忍冬不同药用部位活性成分的提取及含量分析

李 琼

(徐州医药高等职业学校 制药工程系，江苏徐州221116)

忍冬(LonicerajaponicaThunb.)为忍冬科忍冬属植物，其干燥花蕾或其带有初开的花部分被称为金银花[1]，又称忍冬花，可供药用；茎枝名忍冬藤，也可供药用。忍冬在我国大部分地区多有分布，且不少地方已栽培生产，其中以河南、山东所产最为闻名。忍冬花性寒、味甘，适用于急性热病的发热、皮肤肿毒、咽喉肿痛等[2]。该药材是我国卫生部、国家食品药品监督管理局规定的贵重品种。近年来，忍冬花蕾在制药、香料、化妆品、保健品和食品饮料等领域被广泛使用。若忍冬的藤、叶和根部也能被开发利用，将能产生巨大的经济和社会效益。

目前，我国学者已对忍冬花蕾中的活性成分进行了大量研究[2-5]，结果发现：忍冬花蕾中主要化学成分为有机酸及黄酮类化合物。还有大量研究表明：忍冬叶、藤和嫩根中都含有一定的黄酮、有机酸等化合物[2-5]。

有机酸被认为是忍冬花蕾中主要起抗菌活性作用的化学物质，也是鉴定及评价忍冬花蕾品质的标志性成分[6]。有机酸类化合物包括绿原酸、异绿原酸等。《中国药典》2015年版第一部[1]规定：绿原酸干燥品质量分数不得少于1.5%。绿原酸(chlorogenic acid，CHA)是一种多酚类化合物，该化合物除了可以溶解于水，尤其是热水，还可以溶解于稀乙醇、丙酮等溶剂，是淡黄色的固体，在微酸条件下稳定，分子式为C16H18O9，分子结构见图1。

图1 绿原酸分子结构Fig.1 Molecular structure of CHA

黄酮类化合物泛指2个具有酚羟基的芳香环(A-与 B-环)，通过中央3个碳原子互相联结而成的一系列化合物，其基本母核为 2-苯基色原酮，常与糖结合成苷[7]。忍冬花蕾中主要的黄酮类物质有木犀草苷、木犀草素和芦丁等。其中，木犀草苷是用来区分忍冬花蕾与山银花的标志性化合物。

本研究以河南省封丘县所产忍冬整株生药作为研究对象，使用乙醇回流提取法、超声波提取法和索氏提取法3种提取方法对忍冬的花蕾、藤、叶和根部分进行提取；对提取物使用薄层色谱法(TLC)、紫外光谱法(UV)和高效液相色谱法(HPLC)进行定性及定量分析。分析比较几种提取方法对各部位的提取物中绿原酸和总黄酮含量的影响，以期为选择适宜的提取方法提供依据，也为忍冬资源的综合开发和高效利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 药材与试剂

供试药材为河南封丘县黄德镇所种植的忍冬(LonicerajaponicaThunb.)“金封一号”，采收于2015年11月底。为排除生长环境对其的影响，选择生长环境相似，长势相近且直径为5 m内的整株忍冬花蕾药材作为研究对象。取若干株整株药材，分阶段干燥处理，根据文献[8]的方法处理流程如下：

清洗除去异物泥土等→将生药材的花蕾、藤、叶和根各部分分开→30 ℃左右烘2 h→40 ℃左右烘8 h→50 ℃烘10 h→60 ℃烘至干透→研磨成粉末状→过孔径0.425 mm筛后备用。

无水乙醇、NaOH、HCl(均为化学纯)，乙酸乙酯、乙酸(均为分析纯)、超纯水，徐州南试化学试剂公司；甲醇(色谱纯)，合肥博美生物有限公司；250 mL圆底烧瓶、100 mL量筒，江苏太仓亚邦玻璃仪器厂。

1.2 仪器与设备

FR10型超声波发生器，杭州法兰特超声波科技有限公司；SY-5000旋转蒸发仪，上海亚荣仪器厂；300 g(精度0.01 g)电子天平，上海华潮电气有限公司；TLC层析板，青岛海晶化工厂；层析缸，自制；Gel Doc XR型Bio-Rad紫外成像系统，美国伯乐有限公司；10 μL移液枪，徐州南试化学试剂公司；100 mg绿原酸标准品、100 mg芦丁标准品，中国药品生物制品鉴定所；10AVP-10AT型高效液相色谱仪(HPLC)，日本岛津公司；T6型紫外(UV)-可见分光光度计，南京新中惠科学器材有限公司。

1.3 提取方法

1.3.1 加热回流提取法

精密称量忍冬花蕾、藤、叶和根部粉末各10 g，按料液比(g/mL)1∶ 8，分别用体积分数为70%(下同)乙醇溶液混合。在pH为4.0、温度恒定60 ℃的条件下振荡回流提取2次，每次提取2 h。此时所得的提取液不仅浓度过低，而且还有鞣质和蛋白质等杂质。故先减压真空抽滤，再加水沉淀上述杂质。然后在50 ℃水浴下，使用旋转蒸发仪将提取液浓缩至10 mL(使得药液中生药质量浓度为1 g/mL)，经121 ℃压力蒸汽灭菌后冷藏于4 ℃冰箱备用。

1.3.2 超声波提取法

精密称量忍冬花蕾、藤、叶和根部粉末各10.0 g，分别用少量体积分数70%(下同)乙醇溶液将粉末预浸12 h；按料液比(体积比为1∶ 8)加入70%乙醇溶液，调节pH为4.0，超声(25 Hz)提取2次，每次0.5 h；同上先加水沉淀鞣质和蛋白质等杂质，然后在50 ℃水浴下使用旋转蒸发仪将提取液浓缩至10 mL(药液中生药质量浓度为1 g/mL)，经121 ℃压力蒸汽灭菌后冷藏于4 ℃冰箱备用。

1.3.3 索氏提取法

精密称量忍冬花蕾、藤、叶和根部粉末各10.0 g，按料液比(g/mL)1∶ 8，分别用70%乙醇溶液混合。用超声波清洗器(25 Hz)处理0.5 h，在pH为4.0、温度恒定60 ℃的条件下进行索氏提取2次，每次提取2 h[9]。以上述方法沉淀操作后，在50 ℃恒温水浴下使用旋转蒸发仪，将提取液浓缩至10 mL(药液中生药质量浓度为1 g/mL)，经121 ℃压力蒸汽灭菌后冷藏于4 ℃冰箱备用。

为了方便后期数据处理，避免混淆和错误，将3种方法对忍冬的4个药用部位的提取物用代码A、B、C分别表示(表1)。

表1 用不同提取方法提取忍冬不同药用部位粗提方案的代码

1.4 绿原酸的TLC鉴定

实验步骤：配制流动相30 mL，V(乙酸乙酯)∶V(水)∶V(乙酸)为10∶ 3∶ 2；在层析缸中倒入适量流动相，准备表1中的粗提物A1～A4，B1～B4和C1～C4。取10 μL移液枪，逐一吸取以上粗提物溶液，分别点于不同TLC层析板上，待层析板挥发干后，将其置于层析缸内层析，此过程需保证缸体密闭。20 min后取出层析板，置于通风处，挥发干层析板溶剂后，利用Bio-Rad紫外成像系统获取层析图谱。

1.5 绿原酸的HPLC定量分析

1.5.1 绿原酸标准的HPLC图谱测定

按文献[10]的方法进行HPLC测定。在9.89 min时检测到的物质为绿原酸，采用外标法(图2)对待测样品进行定性分析。

图2 绿原酸标准品的HPLC图谱Fig.2 HPLC spectrum of CHA standard

1.5.2 线性关系的考察和标准曲线的绘制

取绿原酸标准品和体积分数为50%的甲醇溶液，精密配制成2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 μg/mL的绿原酸标准品溶液，取绿原酸质量浓度为4.0 μg/mL的溶液，设置进样体积分别为2、4、8、12、16和20 μL。

取已配制好的6个质量浓度(2.0～12.0 μg/mL)的溶液，每个浓度的进样20 μL，按同样的色谱条件进行测定，以质量浓度(ρ)为X轴，峰面积(V)为Y轴作标准曲线图。

1.5.3 重现性考察

精密称取忍冬花干粉末6份，置于100 mL锥形瓶中，精密加入50%(体积分数，下同)甲醇至刻度。用功率250 W、频率35 Hz超声处理30 min，放冷后用甲醇补足体积，摇匀后滤过，用移液管精密量取续滤液5 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加50%甲醇定容，进样量10 μL，进样6次。

1.5.4 精密度考察

取配制好的供试液，按上述同样的色谱条件下进样量10 μL，进样6次。

1.5.5 供试品溶液的制备

参照文献[11]的方法，取以上3种提取方法所得的粗提物A1～A4、B1～B4和C1～C4，用移液管精密量取1 mL，分别置于50 mL容量瓶中，加50%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W、频率33 kHz)30 min，待冷却后称定质量，使用50%甲醇补足损失质量，摇匀后滤过，准确量取续滤液5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度即得。

1.5.6 供试品的测定

逐一量取待测样品，准确进样，测定峰面积。然后根据峰面积及回归方程计算各粗提物中绿原酸的浓度。

1.6 总黄酮的UV定量分析

1.6.1 芦丁标准品溶液的配制

精密称取芦丁标准品37.50 mg(由于芦丁易吸水受潮，为了准确起见，称量前需将芦丁标准品放入120 ℃恒温箱干燥至质量恒定)，置于50 mL容量瓶中，加入适量95%乙醇溶解，超声1～2 min助溶后用95%乙醇定容至50 mL，摇匀备用。

1.6.2 测定波长的确定

参照文献[12]的方法：首先，准备25 mL棕色容量瓶，精密量取上述已配制好的芦丁标准品溶液1 mL，加入1 mL体积分数5% NaNO2溶液后混匀；再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀；加入10%NaOH溶液10 mL，再加入 95%乙醇至25 mL，摇匀。取显色后的溶液适量，于波长400～600 nm范围内扫描，发现标准品的最大吸收波长为505 nm。因此，确定505 nm为测定波长。

1.6.3 标准曲线的绘制

取芦丁标准品，配制0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的溶液，以95%乙醇溶液作为空白对照，在波长505 nm处测定吸收度A，以质量浓度(ρ)为X轴，吸收度(A)为Y轴绘制标准曲线。

1.6.4 样品的制备

参照文献[13]的方法：精密称取3种提取方法提取的忍冬各部位的粗提物各10 mL，各取15 mL的乙酸乙酯加入粗提物中，混匀后萃取3次，取上层液，置于60 ℃水浴蒸干后得浸膏。将浸膏加入100 mL容量瓶，用0.5% Na2CO3溶液定容至刻度后，精密量取4 mL该溶液至250 mL容量瓶中，用0.5%Na2CO3溶液定容至刻度，摇匀备用[14]。

1.6.5 样品的测定

取样品溶液，以提取试剂为空白，在505 nm处测定吸光度，重复测定3次后计算平均值。

1.6.6 精密度试验

取忍冬花蕾样品适量(以黄酮计约6.9 mg/mL)，显色后测定5次。

1.6.7 回收率试验

取已知含量的忍冬花蕾样品1 mL，分别加入芦丁标准品适量，测定并计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 绿原酸的TLC定性测定结果

经薄层色谱法(TLC)鉴定，层析20 min后，粗提物A1～A4、B1～B4和C1～C4的图谱见图3。由图3可知：其比移值Rf值为0.68，分离效果较好；说明此方法可以确定忍冬的花蕾、叶、藤和根部中均含有绿原酸。

图3 绿原酸的TLC定性测定图谱Fig.3 TLC qualitative determination of CHA

2.2 绿原酸的HPLC定量测定结果

2.2.1 线性关系的考察结果

记录不同进样量下峰面积的变化，进样量与峰面积对应关系见表2。

表2 HPLC法线性关系考察

2.2.2 标准曲线

按上述色谱条件进行测定，以质量浓度(ρ)为X轴，峰面积(V)为Y轴作图，得绿原酸标准曲线方程Y=51 794X-5 779，R=0.999 2。由此可知在2～12 μg/mL的范围内线性关系良好(图4)。

图4 绿原酸HPLC标准曲线Fig.4 CHA standard curve of HPLC

2.2.3 重现性的考察结果

在同等条件下将6份供试品溶液进样测定，计算各成分含量的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)，结果见表3。由表3可知：绿原酸含量的RSD为2.47%，表明该方法重复性较好。

图5 忍冬藤-乙醇回流提取的HPLC图谱Fig.5 HPLC spectrum of honeysuckle-ethanol reflux extraction

表3 HPLC法的重复性考察

Table 3 Investigation of repeatability relationship by HPLC

序号药物质量/g峰面积/mm2绿原酸质量分数/%RSD/%11.003 49453.5821.003 59453.5931.006 69583.8041.001 29233.3751.005 59513.7661.005 69513.762.47

2.2.4 精密度的考察结果

取同一供试品溶液，连续进样6次，每次10 μL，在同等条件下测定并计算各成分峰面积的 RSD，结果表明：绿原酸峰面积的RSD为0.11%，说明精密度良好。

2.2.5 供试品的测定结果

在同样色谱条件下，逐一取待测样品，进样测定峰面积。在9.957 min时检测到的物质为绿原酸，采用外标法计算，由于样品较多，仅选用乙醇回流提取的忍冬藤提取物的HPLC图谱作为代表，结果见图5。

根据测定的峰面积和回归方程计算各粗提物中绿原酸的浓度，得3种提取法对忍冬各部位提取物中绿原酸的含量，在忍冬所有部位中均检测到了绿原酸，结果见表4。由表4可知：同一提取条件下，绿原酸的含量高低依次为花蕾、叶、藤、根部。提取效率最高的是索氏提取法，最低的是乙醇回流法。

2.3 总黄酮含量的UV法测定

2.3.1 标准曲线

取配制好的质量浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08和0.10 mg/mL的溶液，以95%乙醇溶液作为空白对照，在波长505 nm处测定吸光度值，以质量浓度(ρ)为X轴，吸光度(A)为Y轴，绘制标准曲线回归方程为A=12.124ρ-0.020 7(R2=0.999 7)，结果见图6。由图6可知：在0.02～0.10 mg/mL范围内，芦丁标准品的线性关系良好。

表4 HPLC法测定绿原酸含量

图6 UV测定芦丁标准曲线Fig.6 The standard curve of rutin by UV

2.3.2 样品的测定结果

取配制好的样品溶液，以提取试剂为空白，在505 nm处测定吸光度，重复测定3次计算平均值。根据吸光度值计算黄酮含量，结果见表5。由表5可知：同一提取条件下，总黄酮的含量高低依次为忍冬叶、花蕾、藤、根，以索氏提取法的提取效率最高，各部位的黄酮含量普遍较高。

表5 UV法测定总黄酮含量

2.3.3 精密度试验结果

取忍冬花蕾样品适量(以黄酮计约6.9 mg/mL)，显色后测定5次并计算RSD值，结果见表6。由表6可知：黄酮浓度的RSD为0.65%，表明精密度良好。

表6 精密度实验结果

2.3.4 回收率试验结果

取已知含量的忍冬花蕾样品1 mL，分别加入芦丁标准品适量，测定并计算回收率，结果见表7。由表7可知：平均回收率为100.05%，RSD值为0.46%，说明本实验回收率较好。

表7 回收率实验结果

3 结论

1)乙醇加热回流法、超声提取法和索氏提取法3种提取方法所得的粗提物，通过TLC定性实验，发现这3种提取方法对忍冬的花蕾、叶、藤和根的粗提物中都检测到了绿原酸。

2)3种提取方法所得的粗提物，通过HPLC法对各部位含有的绿原酸定量实验中发现：绿原酸的含量从高到低依次为花蕾、叶、藤和根部。由此可知：绿原酸含量在花蕾中含量最高，符合《中国药典》(2015版)规定。

3)3种提取方法所得的粗提物，通过UV法对各部位含有的总黄酮定量实验中发现：各部位总黄酮的含量从高到低依次为叶、花蕾、藤和根部。由此可知：总黄酮含量在忍冬叶中含量最高。而忍冬叶的产量远高于忍冬花蕾，约为花的10倍。如果能够合理开发利用忍冬叶，不仅可以节约能源，还能产生较大的经济价值。

4)提取效率从低到高排列是乙醇回流提取法、超声提取法和索氏提取法。索氏提取法提取的忍冬花蕾、叶、藤和根部中绿原酸质量分数分别为4.7%、3.0%、3.2%和2.1%，总黄酮的质量分数分别为6.9%、9.2%、3.6%和1.9%。4个部位中所含的绿原酸都超过了《中国药典》2015版中规定的1.5%。可见选择合适的提取方法，对于提高忍冬的综合利用率很有好处。

综上所述，本研究通过3种提取方法的对比，得出了提取效率最高的方法，为提高忍冬的提取效率提供了理论基础。对比同一提取条件下整株忍冬不同部位中的绿原酸和总量酮含量，为忍冬的综合开发利用提供了理论基础。