Box-Behnken法优化大叶榉树黄酮类超声辅助提取方法及初步鉴定

刘晓玲，金晓玲,2，张旻桓，张亚平,3，曾 艳，柴弋霞

（1.中南林业科技大学风景园林学院，湖南 长沙 410004；2.湖南省环境资源植物开发与利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410000；3.贵州农业职业学院，贵州 贵阳 551400）

大叶榉树Zelkova schneideriana秋叶颜色丰富，五彩缤纷，是营造园林秋景的乡土树种[1]。对大叶榉树秋季叶色成色原理的研究，主要集中在叶绿素、类胡萝卜素和花青苷的含量和变化规律上，少有涉及除花青苷外的其他黄酮类物质[2-3]。但黄酮类作为植物体内重要的次生代谢物质，在植物叶片成色上起着重要作用。如‘北陆’Vaccinium corymbosum×V.angustifolium叶片变红与黄酮醇含量显著相关；芦丁等单体酚是三叶海棠Malus sieboldii叶片成色的主要辅色素[4-5]。这些研究表明，除花青苷外，大叶榉树叶片成色或还与其余的黄酮类物质密切相关。

然而，要对大叶榉树黄酮类深入研究，必须获得其提取方法。现有研究中，Box-Behnken法具有可减少实验组数、缩短试验周期、能求得高精度回归模型、还能通过响应面图反映因素之间的交互作用等优点，被认为比传统的单因素和正交试验设计更精准可靠[6-7]，已在串叶松香草Silphium perfolialum，黄秋葵Abelmoschu sesculentus，落花生Arachishy pogaea以及艾Artemisia argyi等植物的黄酮类物质提取中得到了很好的应用[8-11]。

因此通过Box-Behnken实验设计，筛选大叶榉树叶片黄酮类提取的最优条件，并通过显色反应初步确定大叶榉树叶片中的黄酮类物质的种类，为之后进一步研究大叶榉树叶片黄酮类与成色之间的关系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

2017年8月26日，在湖南长沙南方林业生态应用技术国家工程实验室温室，随机采摘27株1年生大叶榉树嫁接苗，取每株中部成熟叶片1～3片。

1.2 实验方法

1.2.1 大叶榉树叶片黄酮类提取流程 提取的基本流程：大叶榉树叶片→去除叶中脉与锯齿→液氮研磨→-20℃冻干粉末→超声波（180 W，40 KHz）下乙醇提取→10 000 r·min-1离心（TGL-20M台式高速冷冻离心机）→上清液→测定黄酮类提取量。

1.2.2 黄酮类提取量的测定方法 采用铝盐显色法[12]，横坐标为槲皮素标准溶液的质量浓度，纵坐标为测定的吸光度值，获得标准曲线Y=1.098 4X+0.020 6（R2=0.996 1）。根据标准曲线计算大叶榉树叶片提取液黄酮类浓度后，提取量根据如下计算公式求得：

式中，P表示黄酮类提取量（mg·g-1）；c表示提取液黄酮类浓度（mg·mL-1）；V表示提取液体积（mL）；m表示冻干粉末质量（g）。

1.2.3 大叶榉树叶片黄酮类提取的单因素试验 以黄酮类提取量为因变量，超声波功率固定为180 W，频率为40 KHz，乙醇浓度、液料比、超声时间3个因素分别以60%，20:1mL·g-1，2 h为基础，依次改变其中1个因素进行大叶榉树叶片黄酮类提取试验（试验平行数为3，下同）。每个因素设置7个水平梯度：乙醇浓度范围30%～90%，梯度间隔10%；液料比范围5:1～35:1mL·g-1，梯度间隔5:1；超声时间范围0.5～3.5 h，梯度间隔0.5 h。分析不同梯度对大叶榉树叶片黄酮类提取量的影响。按照1.2.1的方法获得大叶榉树叶片黄酮类提取液，根据1.2.2的方法计算黄酮类提取量。

1.2.4 Box-Behnken实验设计 根据单因素实验结果，每个因素优选出3个水平，乙醇浓度（A）为：50%，60%，70%；液料比（B）为：25:1，30:1，35:1mL·g-1；超声时间（C）为：1.0，1.5，2.0 h，以大叶榉树叶片黄酮类提取量为响应值，设计3因素3水平Box-Behnken的中心组合方案（表1）。

1.2.5 大叶榉树叶片黄酮类物质的初步鉴定 根据Box-Behnken的最佳提取方案获得提取液，通过显色反应对黄酮类物质进行初步鉴定，试验方法参照参考文献13。

1.3 数据分析

数据分析采用Excel 2007，SPSS 19和Design-Expert.V8.0.6，作图采用Origin 8.5。

2 结果与分析

2.1 单个因素对黄酮类物质提取量的影响

2.1.1 乙醇浓度对黄酮类提取量的影响 乙醇浓度对大叶榉树叶片黄酮类提取量的影响显著（P＜0.05，下同）（图1）。随着乙醇浓度的升高，黄酮类提取量呈先增大后减少的趋势，当乙醇浓度为60%时，提取量最大30.39mg·g-1，而在60%～90%时显著减少。根据实验，选取60%乙醇作为大叶榉树叶片黄酮类提取的最佳浓度值。

2.1.2 液料比对黄酮类提取量的影响 从图1可知，液料比对大叶榉树叶片黄酮类提取量有显著的影响。随着液料比增大，黄酮类提取量呈现先增大后减少的趋势，当液料比为 30:1mL·g-1时，提取量最大 29.75mg·g-1。

2.1.3 提取时间对黄酮类提取量的影响 提取时间与大叶榉树叶片黄酮类提取量的相互关系见图1。随着提取时间的增加，大叶榉树叶片中黄酮类的提取量先增大而后减少，在1.5 h时，提取量最大24.09mg·g-1。超过1.5 h后，提取量反而下降，因此选择1.5 h为超声处理最佳时间。

图1 乙醇浓度、液料比、提取时间对大叶榉树叶片黄酮类提取量的影响Figure1 Effect of ethanol concentration,liquid ratio and extracting time on flavonoid yield from Z.schneideriana leaves

2.2 Box-Behnken设计对提取方法的优化

2.2.1 大叶榉树叶片黄酮类提取的回归模型 以单因素实验结果为基础，采用Box-Behnken设计原理，对A（50%，60%，70%），B（25:1，30:1，35:1）mL·g-1，C（1.0，1.5，2.0 h）这3个因素及对应的水平，进行响应面实验设计，实验设计方案与结果见表1。

表1 Box-Behnken实验设计及效应值Table1 Box-Behnken design and effect

根据软件对试验结果进行分析，得到大叶榉树叶片黄酮类提取的回归模型为：

y=30.54+1.48A+1.39B+2.22C-0.54AB-0.25AC-0.26BC-2.36A2-3.50B2-2.19C2。

2.2.2 回归模型方差分析 对Box-Behnken实验结果进行方差分析，结果见表2。

由表2可知，该回归模型差异显著（P＜0.05），相关系数R2=0.921 9。表明92.19%的实验数据可以用该模型进行解释，证明预测值与实验值有较高的相关性。失拟项P值0.217 2＞0.05，差异不显著，说明实验误差小。因此，该模型对于大叶榉树叶片黄酮类提取量实际值与预测值之间具有较好的拟合度。

表2 实验结果方差分析Figure2 ANOVA on experiment result

2.2.3 Box-Behnken的优化结果 图2a为提取大叶榉树叶片黄酮类物质的乙醇浓度与液料比响应面图，图2b为乙醇浓度与提取时间响应面图，图2c为液料比与提取时间的响应面图。响应面图开口向下，表明各因素作用增大时，响应面值增大，达到最高点后，各因素作用增大，响应面值减小。由图2可以得出，3个因素两两之间形成的响应面图开口均向下，说明其对提取率的影响都是先增大后减少。

图2 各因素之间响应面图Figure2 The response surface between various factors

图3a为提取大叶榉树叶片黄酮类物质的乙醇浓度与液料比等值线图，图3b为乙醇浓度与提取时间等值线图，图3c为液料比与提取时间的等值线图。等值线图从圆到扁的变化，表示两个因子之间相互关系从弱到强程度，越扁表示两因素交互影响越强。由图3中等值线形状可见，两两因素之间的交互作用对大叶榉树黄酮类提取量的影响次序是：乙醇浓度与液料比＞乙醇浓度与提取时间＞液料比与提取时间。

2.2.4 最佳提取方法的确定及验证实验 根据二次线性回归模型得出，大叶榉树叶片黄酮类提取的最优条件为：乙醇浓度62.7%，液料比30.8:1mL·g-1，提取时间1.74 h，黄酮类的预测提取量为31.383 mL·g-1，但考虑实际可操作性，确定大叶榉树叶片黄酮类的提取方法为：乙醇浓度63%，液料比31:1mL·g-1，提取时间1.7 h，根据此条件，设置平行数为6的重复试验，得到大叶榉树叶片黄酮类的提取量平均值为（31.067±0.11)mL·g-1，与模型所预测的基本一致，说明模型能较好预测实际值。

图3 各因素之间等值线图Figure3 The contour between the factors

2.3 大叶榉树叶片黄酮类物质提取液的初步鉴定

用简单的显色反应可以初步鉴定大叶榉树叶片提取物中黄酮类物质的存在，参照对野生百合Lilium brownievar.viridulum显色反应对应的结果分析[13]，大叶榉树叶片提取液通过浓盐酸-锌粉反应，溶液呈现紫红色，说明大叶榉树叶片中可能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物；大叶榉树提取液与三氯化铝反应，呈现淡黄色，表明存在黄酮；与醋酸铅反应，出现黄色沉淀，说明具有邻二酚羟基或兼有3-OH，4=O或5-OH，4=O的化合物，大叶榉树黄酮类提取液中不含查耳酮和橙酮；与氨性氯化锶反应产生黄棕沉淀，意味着色素分子中有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物。与硼酸反应，颜色变化不明显，说明大叶榉树叶片含有少量或不含5’-羟基黄酮及2’-羟基査尔酮。

3 结论与讨论

优化后大叶榉树黄酮类提取方法为：乙醇浓度63%，液料比31:1mL·g-1，提取时间1.7 h，提取量为（31.067±0.11)mL·g-1；3个因素中，乙醇浓度与液料比之间的交互作用最强。通过对大叶榉树叶片黄酮类提取液的显色鉴定，其成分含有黄酮、具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物以及具有邻二苯酚羟基或兼有3-OH，4=O或5-OH，4=O的化合物；可能有黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇等；不含查尔酮和橙酮。

为了更有效的提取植物组织中的黄酮类物质，可采取多种措施。如物理方式：超声波、微波等[14-15]；生物方式：添加果胶酶、纤维素酶等[16-18]，可以加速物质运动或破坏植物细胞结构，使黄酮类物质更好的溶于提取液中。已有研究表明，使用微波辅助，能更有效提取辣木Moringaoleifera叶中黄酮类[19]；在提取香椿Toonasinensis老叶中的黄酮类时，纤维素酶的添加可提高提取量[20]。在本实验预实验阶段发现，超声波作用0.5 h，大叶榉树黄酮类提取量显著高于常温浸提24 h，说明采用超声波辅助提取大叶榉树黄酮类物质，是理想的措施。

在实验的3个因素中，对于大叶榉树黄酮类提取量，乙醇浓度与液料比之间的交互影响最大。可能不同浓度乙醇的极性不同，在乙醇溶液极性与大叶榉树黄酮类最接近时，黄酮类溶解度大，获得的提取量高，当乙醇浓度增大时，大叶榉树叶片黄酮类提取量下降，这除提取液极性减小，相溶性减弱外，叶片中质体色素、非黄酮类醇溶性物质等也会析出溶于溶液，影响黄酮类的提取；而在液料比比值较高时，大叶榉树叶片材料中黄酮类少，溶剂量多，同样非黄酮类的醇溶性物质会溶出，使提取量降低[21]。两个因素在导致提取量降低上有共同成因，所以在大叶榉树叶片黄酮类提取中，这两者交互作用最强。

黄酮类物质多达几千种[22]，确定植物叶片中具体存在的黄酮类物质种类有一定困难。目前，有关大叶榉树叶片黄酮类具体种类的报道鲜见，若直接采用高效液相色谱（HPLC）和色-质联用（LC-MS）等方法，在标准品的选择、时间程序的确立上，耗时久，费用高[23]。通过本研究中系列显色反应，高效便捷的筛选出大叶榉树叶片中含有黄酮和具有邻二酚羟基结构的黄酮类化合物，并可排除查尔酮和橙酮，既缩短了时间，又节省了经费，也为后期深入研究其中具体物质指明了方向。