无患子嫩枝扦插生根机理初探及对不同激素处理的响应

何必庭，何秋阳，刘济铭，史双龙，高世轮，翁学煌，贾黎明

（1.龙泉市林业科学研究院，浙江 龙泉 323700；2.北京林业大学 国家能源非粮生物质原料研发中心，北京 100083；3.福建源华林业生物科技有限公司，福建 三明 354500）

无患子Sapindus mukorossi为无患子科Sapindaceae无患子属Sapindus落叶乔木，广泛分布于亚洲和美洲的热带、亚热带低山丘陵及石灰岩地区[1-3]，主要在我国秦岭淮河以南以散生或小居群形式分布。无患子果皮皂苷和种仁油脂含量丰富，是重要的生物日化、生物柴油、生物医药等原料树种[2-3]。目前，在我国福建、浙江、贵州、云南、湖南等地已陆续发展了数万公顷的人工原料林[4]，但目前栽植多为未经子代测定的实生群体，普遍产量较低。其主要原因是缺乏优良品种及其繁育技术。

扦插育苗是林木优良品种无性快速扩繁的重要手段之一，由于其繁殖系数高、繁殖速度快、操作简易等优势在实际生产中得到广泛应用[5-6]。嫩枝扦插是一个复杂的生理生化过程，受不同植物、不同品种、不同个体、环境以及扦插基质、插穗自身状况、生根激素或生根粉的种类与浓度等因素的影响，成活率表现出巨大差异[7-10]。国内外关于无患子扦插技术的研究已有相关报道，主要集中在扦插插穗类型、扦插基质、扦插时间和激素处理的优选过程。在对无患子扦插试验中发现，通过一定浓度的激素浸泡处理并对扦插环境加以控制，无患子扦插的成活率可达70%以上[11-13]，而阮双兴[14]发现不同浓度NAA处理的无患子穗条成活率不足46%，2年生插穗成活率不足33%。这些差异可能是由于扦插的基质、插穗状况、处理方式等不同导致。目前尚无试验总结出无患子可应用于生产的系统扦插扩繁技术，关于无患子扦插生根机理更是未见相关报道。

在借鉴无患子科树种扦插扩繁技术国内外研究进展的基础上，本文以无患子为研究对象，采用不同激素处理研究无患子嫩枝扦插的生根机理，以期找到适用于无患子的简单快速无性繁殖育苗途径，探索其生根机理，为无患子优良种质快繁提供理论与技术支撑。

1 试验地概况

试验地位于福建省西北部的三明市建宁县，116°35'～117°04'E，26°30'～27°06'N，闽江源头[15]，海拔280～1 858 m，年平均气温16.5～17.5℃，年平均降水量1 800～2 100 mm，多集中于春夏两季，常年相对湿度84%，平均日照时数达1 721 h[16]。土壤为长石砂岩风化母质上发育而成的厚层山地黄红壤，土层厚度＞100 cm，多以红壤为主[17]，质地多为重壤土（卡氏制）至轻黏土，肥力较高，具有良好的水湿条件，适宜林木生长[18]。建宁县森林覆盖率达78.3%，植物种类多达1 300种，近年来大力发展无患子原料林培育，2012年获中国经济林协会授予“中国无患子之乡”称号，是我国发展无患子生物质能源原料林的主要基地。

本试验在福建省建宁县斗埕工业区源容生物科技有限公司扦插大棚中进行。

2 材料与方法

2.1 试验材料

试验材料选自福建省建宁县无患子家系种质资源圃。2017年6月中上旬于晴朗清晨采集3年生实生苗当年生无病虫害健壮嫩枝，长20～100 cm，直径1.5～2 cm。插穗制作在背阴地进行，剪除梢部和基部，下端剪成马蹄形斜切面，上端平切面，去除幼嫩梢部，插穗长10～13 cm。每段插穗保留2～3个芽眼，除去下部所有叶片，保留上部1～2片小叶，叶量较多或叶片过大时将叶片剪去一半或1/3，随采随插随处理。

扦插基质采用泥炭土：珍珠岩以2：1的比例均匀混合，将基质盛装在口径10 cm，深20 cm的PVC育苗容器内，使用1：200 0的多菌灵溶液（多菌灵型号：Zhb/中保生产的PD85150-2杀菌剂XK13-003-00387）浇透容器内基质进行消毒。在扦插大棚内苗床上挖浅坑，间距25 cm×15 cm，将盛装好基质的容器放置在浅坑内，并用土垒实，防止容器翻倒。

2.2 试验设计

试验采用完全随机区组实验设计，设置3种激素的3种不同浓度，加上清水对照（CK）共10个处理，每个处理3次重复，每个重复25个插穗。激素选用NAA，IAA，GGR6的不同浓度溶液处理插穗，激素浓度分别为 100 mg·L-1，200 mg·L-1，500 mg·L-1，处理时间将插穗基部4 cm左右激素浸泡1 h，激素种类与浓度组合设计见表1。

为便于观察扦插苗生根情况，另取100根插穗使用200 mg·L-1GGR6处理1 h并进行扦插，作为破坏性试验所需的扦插苗。

表1 不同激素处理及水平Table1 Different hormones with different levels

2.3 插后管理

将处理后的插穗直插入基质中，芽眼朝上，插穗上端3～5 cm露出基质，插后将孔口缝隙捏实以使插穗基部与基质完全接触。扦插后采用棚内自动喷雾装置进行管理（10:00-17:00，每30 min喷雾1次，每次3 min），喷雾同时起到了维持空气湿度和基质水分的作用，使白天棚内空气温度维持在25～30℃，相对空气湿度在80%左右，同时扦插基质始终保持湿润状态。生根后则适当控制水分，并喷施2 000倍液的多菌灵。及时除去棚中杂草。阴雨天适当关闭喷雾装置，防止水分过多导致棚内过于潮湿，使扦插苗涝死。

2.4 扦插育苗生根解剖学研究

扦插后每隔5 d将破坏性试验苗随机拔出1～2根，观察愈伤组织生长及生根情况。扦插前取3根未经处理的插穗，扦插后每隔2周随机抽取3根插穗进行观察并保存，与未处理的插穗一起制作石蜡切片，取代表性切片通过显微镜观察拍照。

2.5 指标测定方法

2.5.1 插穗成活率的测定 2017年11月对扦插成活率进行观测统计。

2.5.2 幼苗生物量、根系指标的测定 在观测结束后对无患子扦插苗进行采样。每个处理随机采集3株扦插苗全部叶片与根系，分别放入信封并标号，当天将叶片烘干至恒重，使用电子天平（赛多利斯公司产，型号SQP）称量其生物量并记录；将根系清水洗净，用EPSON扫描仪（EPSON公司产，型号V19）和Epson Twain Pro根系扫描系统进行扫描，得到根系数据。扫描结束后将根系装回信封并烘干至恒重，使用电子天平称量其生物量并记录。称量后的根、叶装回信封保存待测。

2.5.3 幼苗营养成分的测定 将烘干后的根、茎、叶样品使用球磨仪（德国RETSCH，冷冻混合研磨仪MM400）粉碎并保存在干燥洁净的自封袋中并标上样品序号。按照消煮流程将样品消煮后，将得到的消煮液倒入标有样品序号的100 ml小口方瓶（hdpe材质方形水剂瓶）内待测。

使用AA3连续流动化学分析仪（德国SEAL产，型号AA3）测定待测样品的含磷量与含氮量。

2.6 数据分析

采用SPSS Statistics 20对试验数据进行One-wayANOVA分析，如处理间差异显著，采用Duncan法在0.05或0.01水平上进行多重比较。采用Microsoft Excel 2016进行图表绘制。

3 结果与分析

3.1 嫩枝扦插成苗过程及其生根类型

嫩枝扦插过程中，愈伤组织约在25 d后出现，28 d时大量形成愈伤组织，33 d出现不定根，40 d正常生长形成茁壮苗木，70 d根团形成，扦插苗木可移栽定植（图1）。对不同时期无患子嫩枝扦插苗木通过形态观测和切片观察，发现嫩枝扦插苗于28 d于皮下形成根原基，33 d形成不定根（图2），生根部位多集中于皮下和愈伤组织中（图3）。

图1 无患子嫩枝扦插苗（200 mg·L-1GGR6处理）15，30，70 d时生根情况Figure1 Rooting of cuttings 15,30 and 70 days after treatment of 200 mg·L-1GGR6

图2 无患子扦插苗皮下生根（左）与愈伤组织生根（右）Figure2 Rooting from hypodermis(left)and callus(right)of cutting

图3 无患子嫩枝扦插基部切片观测Figure3 Slice observation of cutting base

3.2 不同激素处理对嫩枝扦插成活率的影响

研究表明（图4），采用GGR6，IAA及NAA处理可显著提高无患子嫩枝扦插成活率（P＜0.05），方差分析表明多数处理与对照相比差异显著（P＜0.05）（除c’13，c’22，c’32）。多重比较发现c’31处理下成活率显著高于其他处理（P＜0.05），扦插成活率可达46.96%，比CK高42.24%；其次是c’12处理成活率达33.15%。综合分析认为，200 mg·L-1GGR6处理成活率最高，500 mg·L-1IAA处理成活率最高，100 mg·L-1NAA处理成活率最高。

3.3 不同激素处理对嫩枝扦插苗生物量的影响

由图5分析表明，各处理相比于CK，扦插苗生物量均有所提高，其中部分处理差异显著（P＜0.05）。c’31处理的总生物量生长最高达到3.05 g，比CK处理高出将近6.5倍；平均每株扦插苗根、叶最高生物量分别达到1.32 g，1.73 g，分别比CK高出915%，409%。多重比较发现c’31处理嫩枝扦插苗根、叶总生物量最高，其次为c’22。综合分析也发现随着GGR6，NAA激素处理浓度的升高，嫩枝扦插苗根、叶生物量都逐渐下降，IAA激素则在200 mg·L-1处达到峰值，500 mg·L-1处跌入谷底。

图4 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插成活率 Figure4 Survival rate of cuttings treated by different hormones and different concentrations

注：图中不同字母表示差异达显著水平（P＜0.05），下同。

3.4 不同激素处理对嫩枝扦插苗营养成分的影响

由图6可看出，各处理相比于CK，嫩枝扦插苗根、茎、叶含氮量均有所提高，最高的分别是c’22，c’33，c’11，达到 4.90 mg·kg-1，3.50 mg·kg-1，6.04 mg·kg-1，分别比 CK 高出 227%，90%，158%。方差分析表明多数处理根、茎、叶含氮量存在显著性差异。多重比较表明，IAA，NAA处理下根含氮量显著高于CK与GGR6处理（P＜0.05），在500 mg·L-1NAA处理下的茎含氮量显著高于其他处理（P＜0.05），在100 mg·L-1GGR6处理下叶含氮量显著高于其他处理（P＜0.05）。分析认为GGR6可有效提高嫩枝扦插苗叶含氮量，NAA能有效提高根、茎部分含氮量。

图6 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插苗根、茎和叶的含氮量Figure6 Nitrogen content in root,stem and leaf of cutting treated by different hormones and concentrations

图7 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插苗 根、叶的含磷量Figure7 Phosphorus content in root and leaf of cuttings treated by different hormones and concentrations

由图7可知，各处理相比于CK，嫩枝扦插苗叶、根含磷量均有所提高，大部分处理茎含磷量并无显著差异，其中c’21处理下叶含磷量最高，达到2.47 mg·kg-1，比CK处理高出1.51 mg·kg-1；c’11处理下根含磷量最高，达到1.34 mg·kg-1，比CK处理高出1.2 mg·kg-1。方差分析表明，多数处理间有极显著差异（P＜0.01）。多重比较表明c’21和c’11的叶、根含磷量显著高于其他处理（P＜0.05），同时在各激素中低浓度处理下根含磷量差异并不显著，但显著区别于CK、c’23和c’33处理（P＜0.05）。

3.5 不同激素处理对嫩枝扦插苗根系的影响

各处理根系总根长、根表面积、根体积及平均直径均显著高于CK（P＜0.05）（图8至图11）。其中c’31扦插苗总根长、根表面积及根体积均为最高，达到15.65 m，170.25 cm2，2.19 cm3，分别高出CK 15.1倍、7.17倍、13.06倍。单因素方差分析、多重比较也发现c’31的根系指标显著高于其他处理，表明NAA100 mg·L-1处理确实可以有效提高嫩枝扦插苗根系的生长。此外NAA处理下无患子嫩枝扦插苗根系总根长、表面积及根体积也显著高于GGR6和IAA处理，分析认为NAA相比于IAA和GGR6可更有效促进无患子嫩枝扦插苗根系的生长。

图8 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插苗总根长Figure8 Total root length of cuttings treated by different hormones and concentrations

图9 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插苗根表面积Figure9 Root surface area of cuttings treated by different hormones and concentrations

图10 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插苗根体积Figure10 Root volume of cuttings treated by different hormones and concentrations

图11 不同激素及浓度下无患子嫩枝扦插苗根平均直径Figure11 Mean root diameter of cuttings treated by different hormones and concentrations

4 结论与讨论

4.1 无患子嫩枝扦插的生根型

扦插插穗生根过程可概括为：根原始体转变分生组织，进一步分化为根原基，从而形成不定根[19-21]。按照根原基形成的部位、时间以及形成机制，可将插穗生根类型分为三种，即皮部生根型[21-22]、愈伤组织生根型[23]和中间生根型[24-27]。在无患子科的扦插研究中，宗建伟发现文冠果Xanthoceras sorbifolium生根类型属于愈伤组织生根[28]。国内外对于无患子嫩枝扦插的相关试验中鲜见对嫩枝扦插生根机理的研究[11-13]。

本研究发现无患子嫩枝扦插过程中，扦插后25 d出现愈伤组织，33 d出现不定根，40 d后可生长形成健壮苗木。通过不同时期切片观测，发现扦插后28 d皮下形成根原基，33 d后形成不定根，且生根部位多集中于皮下和愈伤组织中。因此推测无患子嫩枝扦插生根方式属于皮部生根型和愈伤组织生根型相结合的方式，即中间生根型。

4.2 外源激素处理对无患子嫩枝扦插的影响

研究表明植物营养物质、生长激素、生根辅助因子及抑制剂对插穗生根过程中发生的生理生化变化有着重要影响[28-31]。宗建伟[32]等研究发现IBA 795～820 mg·L-1处理对文冠果扦插苗不同径级根长、根表面积、根体积等根系指标造成显著影响，改变根系的形态构成。程水源等试验表明扦插不定根的形成与扦插苗内酶与内源激素的含量相关[31,33]。

本研究对无患子嫩枝采用了GGR6，IAA及NAA不同浓度进行处理，扦插成活率有不同程度的提高，其中NAA100 mg·L-1处理成活率可达到46.96%，较CK处理高42.24%。同时NAA处理可有效促进插穗根系生长，NAA 100 mg·L-1处理下扦插苗当年总根长（15.65 m）、根表面积（170.25 cm2）及根体积（2.19 cm3）均达到峰值，分别比CK高出15.1倍、7.17倍、13.06倍。不同激素处理也可提高无患子嫩枝扦插苗根、茎、叶生物量和营养成分，其中NAA100 mg·L-1处理下根、叶当年总生物量最高。可见一定浓度激素处理对无患子嫩枝扦插有显著促进作用，其中NAA相比于GGR6和IAA能更有效促进无患子嫩枝扦插苗成活及生长，本试验中NAA 100 mg·L-1处理为无患子嫩枝扦插的最优激素处理。

研究同时发现随着各激素处理浓度提升，无患子嫩枝扦插成活率并无显著差异，而嫩枝扦插苗的根、叶生物量呈现下降趋势，推测随着激素浓度过高可造成一定程度的生长抑制。营养成分也表现出类似规律，随着各激素浓度的升高，嫩枝扦插苗木根系总根长、根表面积及根体积均呈现下降趋势，推测随着激素浓度的升高，表现出对嫩枝扦插苗木根系生长一定的抑制作用。

4.3 无患子嫩枝扦插技术初步总结

通过试验得出无患子嫩枝扦插繁殖的最佳技术，无患子嫩枝扦插应采集生长健壮母树当年生枝条制穗，插穗长度10～13 cm，每段插穗保留2～3个芽眼，除去下部所有叶片，保留上部1～2片小叶。采用NAA激素100 mg·L-1浸泡插穗基部1 h。设置自动喷雾装置保证空气湿度，并采用遮阳网遮光，避免强光蒸腾失水死亡。结合以上的技术组合，无患子嫩枝扦插成活率可达45%以上。