一株烟草青枯拮抗细菌中活性物质稳定性和粗提物成分分析

吴 翔，谢丽源，甘炳成*，陈 影，彭卫红，谭 昊，黄忠乾

(1.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；2. 农业部西南区域农业微生物资源利用科学观测实验站，四川 成都 610066；3.农业部西南山地农业环境重点实验室，四川 成都 610066)

【研究意义】微生物代谢产生活性物质的提取、纯化一般要经过离心、浓缩、萃取、鉴定等繁琐的程序，它是包括微生物学、分析化学、分子生物学等学科交叉的综合研究技术，技术难度大。更由于微生物代谢产物中活性物质的成分是未知的，在不断的提取、纯化过程中要通过活性物质的检测来确定所提取和纯化的物质是否存在活性成分，更加大了该类实验研究的难度。【前人研究进展】因此，目前很多关于微生物代谢产生的活性物质的研究是关于成分的推断和粗提物的性质方面的研究。烟草病害微生物防治研究中针对活性物质的研究不多[1-2]，关于烟草青枯病拮抗菌的活性物质研究报道更少，已有的报道主要包括对活性物质分子量大小分析和主要成分分析。【本研究切入点】本研究前期筛选获得1株对烟草青枯病原菌具有良好拮抗效果的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)MT-002-B-7，为了初步了解抑菌物质的基本性质和所含的可能大致成分，对其抑菌活性物质进行了研究。【拟解决的关键问题】在探索拮抗活性物质成分方面，红外光谱分析法和GC-MS分析法是常用到的方法，本研究参照目前已有的研究方法，通过对烟草青枯拮抗菌的活性物质进行离心、浓缩和萃取，主要研究了拮抗菌MT-002-B-7发酵液活性提取物质的基本性质，并结合红外光谱和GC-MS的检测结果分析和推测其中活性可能成分，探索拮抗菌株的拮抗机理，为多功能生物有机肥的开发和生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 从高粱根际土中筛选获得的对烟草青枯病原菌具有较好拮抗效果的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)MT-002-B-7，该菌为革兰氏阴性的好氧细菌。

1.1.2 培养基 LB培养液体培养基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 10.0 g，pH 7.4。

TM培养基：蛋白胨 10.0 g，葡萄糖 5.0 g，酪素水解物 1.0 g，琼脂粉 18.0 g。

1.2 方法

1.2.1 发酵液的制备 将MT-002-B-7接入LB培养液中，28 ℃、转速180 r/min、培养时间24 h即得到发酵好的菌液。

1.2.2 抑菌活性检测方法 将烟草青枯病原菌在TM培养基平皿中培养。用直径为6 mm的打孔器在空白TM培养皿中央打1个孔，再在离平板中心距离相等的3个方向分别打孔。从培养好的病原菌平皿中打孔出同样大小菌饼置于空白培养基的中央孔中，四周孔注入30 μl待测粗提液，于28 ℃正置培养，观测其抑菌情况。

1.2.3 粗提取发酵液活性产物 将MT-002-B-7发酵液6000 r/min离心10 min，取上清液用乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮以1∶1比例萃取，分别萃取3次，减压浓缩测定不同有机相和水相的抑菌活性，以对应有机溶剂作为对照，试验重复3次。

1.2.4 拮抗粗提液稳定性测定[2-3]① 拮抗粗提液的热稳定性。将拮抗粗提液分别在30、40、50、60、70、80、90、100 ℃的水浴中加热30 min，在115、121 ℃的高压锅中加热20 min，以未加热处理的样品为对照，检测各处理液的抑菌活性。② 拮抗粗提液对蛋白酶的稳定性。将拮抗粗提液分别用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K在55 ℃处理3 h，酶反应浓度为1 mg/mL，以未用酶处理的为对照，检测各处理液的抑菌活性。③ 拮抗粗提液对紫外线的稳定性。将拮抗粗提液置于8 W紫外光下，距离20 cm，分别照射1、2、4、6、8、10和24 h，以未用紫外光照射为对照，检测各处理液的抑菌活性。④ 拮抗粗提液活性的有效时间。把拮抗粗提液在室温条件下(25 ℃左右)放置30 d，分别在第3、5、7、10、15、20和30天取样，以刚提取的拮抗粗提物的活性为对照，检测各处理的抑菌活性。⑤ 拮抗粗提液的酸碱稳定性。拮抗粗提液用HCl或NaOH分别调为pH值1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0和14.0 共14个梯度，静置过夜，再分别调pH值至中性，以未处理粗提物为对照，检测各处理的抑菌活性。

1.2.5 粗提物的制备 将发酵液6000 r/min离心10 min，收集上清液，将上清液和乙酸乙酯1∶1比例萃取，收集有机相，并将有机相于旋转蒸发仪中浓缩，浓缩物放置于-20 ℃冰箱预冻过夜，最后用冷冻干燥机冷冻得到拮抗物质干品，备用于后续试验。菌株MT-002-B-7经冷冻干燥后的拮抗物质呈黄白色粉末状，结块处是淡黄色，如图1所示。

1.2.6 粗提物成分分析 ① 红外光谱扫描。将拮抗提取物与干燥的KBr研磨混匀，压片，所制片送往中国科学院成都分院分析测试中心用红外光谱仪在4000～500 cm-1区间扫描。②气相色谱质谱联用仪测定化学成分，将拮抗提取冻干产物送往青岛科标化工分析检测有限公司，用气相色谱质谱联用仪对其成分进行检测，具体检测条件如下：取少量样品用水溶解，再取少量溶液滴加到乙酸乙酯和丙酮1∶1的混合溶液中，混匀、过滤、上机。

图1 冷冻干燥后的拮抗物质Fig.1 Freeze-dried antibiotics production

表1 溶剂萃取成分抑菌活性比较

注：“-”表示无抑菌圈，“NA”表示不溶。

Note: ‘-’ means no inhibitory zone ;‘NA’ means not applicable.

用0.45 μm微孔滤膜过滤，TG-5 MS型色谱柱的升温速率为：初始柱温60 ℃，保持5 min，以3.5 ℃/min升温到100 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升温到200 ℃，保持5 min，以15 ℃/min升温到280 ℃，保持15 min。以不接菌培养液作为对照，分别测定化学物质。

2 结果与分析

2.1 活性代谢产物萃取溶剂的研究

选取乙醚、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、丙酮等有机溶剂对发酵液进行萃取，分别测定其水相和有机相抑菌活性，试验结果如表1所示，表中的数据表明各提取相的抑菌圈大小。用丙酮进行萃取时，出现乳化现象无法分层，因此不能检测其萃取后的结果。而活性物质在氯仿、乙醚、正丁醇等萃取液中没有抑菌活性，说明该物质不溶于此类有机溶剂，而溶于乙酸乙酯等有机溶剂。根据相似相溶原理，该物质能被乙酸乙酯萃取，证明活性物质的极性与乙酸乙酯更为接近，因此选用乙酸乙酯作为发酵上清液的萃取溶剂。

2.2 拮抗粗提液稳定性

2.2.1 热稳定性 粗提液在经过30～121 ℃不同温度阶段处理后，检测其抑菌活性，对照测得抑菌圈大小为34.11 mm，结果如图2所示。粗提液在30～90 ℃温度区间基本能保持抑菌活性稳定，活性同对照相比相差不大，没有达到显著性差异(P>0.05)。但在90 ℃水浴处理后其活性开始有所下降，之后随着处理温度的升高活性逐渐下降，100、115和121 ℃处理后较对照分别下降3.66 %、7.48 %和8.74 %，由此可以看出高于100 ℃，随着温度升高，活性略有降低。由此得知，拮抗活性物质具有一定的热稳定性。

图2 拮抗提取物的热稳定性Fig.2 Thermostability of extractive

图3 不同蛋白酶对拮抗提取物抑菌活性的影响Fig.3 Effects of different protease on activity of crude extract

2.2.2 对蛋白酶的稳定性 用3种不同蛋白酶处理粗提液，以不处理为对照，对照抑菌圈大小为34.11 mm，检测其对烟草青枯病原菌的抑制效果，结果如图3所示。经胃蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶处理后的蛋白酶处理液抑菌圈与对照相比相差不大，没有达到显著差异(P>0.05)，说明粗提液抑菌活性对蛋白酶不敏感。由此推测，拮抗物质中可能不含有蛋白质成分。

2.2.3 对紫外线的稳定性 粗提液经过紫外线照射后，随着照射时间的增加，抑菌活性逐渐降低，如图4所示。紫外照射1、2、4和6 h的抑菌活性与对照34.11 mm的抑菌圈相比没有达到显著性差异(P>0.05)，当照射8 h，抑菌活性显著降低(P<0.05)，抑菌活性为对照的79.7 %，当照射24 h时，抑菌活性极显著低于对照(P<0.01)，抑菌活性仅为对照的64.3 %。研究结果表明，紫外照射时间低于6 h对拮抗物质抑菌活性没有明显影响，而照射时间超过6 h，拮抗物质的抑菌活性显著下降，直到10 h后变化不大。

图4 紫外线照射对拮抗提取物抑菌活性的影响Fig.4 Effects of ultraviolet radiation on activity of crude extract

图5 保存时间对拮抗提取物抑菌活性的影响Fig.5 Effects of store time on activity of crude extract

2.2.4 拮抗物质活性的有效时间 拮抗物质活性随时间的保持能力对该类物质的应用开发非常重要，是考察其应用潜力的重要指标。在放置拮抗物质的30 d中，检测了的7次拮抗提取物质样品抑菌活性，结果如图5所示。不同时间段的检测抑菌活性与对照相比没有达到显著差异(P>0.05)，说明拮抗物质的抑菌活性并没有因为放置时间的延长而降低。

2.2.5 酸碱稳定性 实验未经处理粗提物的抑菌圈大小为32.67 mm。如图6所示，pH值对粗提液的抑菌活性影响很大，在试验的不同pH值范围，抑菌圈直径处于3个主要的阶段。当pH 1～4抑菌活性较低，且不同pH间抑菌活性相差不大(P>0.05)；pH 5～7具有较高的抑菌活性，活性相当于对照的88.5 %～91.4 %，但当pH调整至8之后，抑菌活性急剧下降，极显著(P<0.01)低于pH 5～7时粗提液抑菌活性。由此可见，粗提液在微酸至中性条件下具有较好地抑菌活性，偏酸或偏碱都不能很好地维持粗提液的抑菌活性。尽管经过pH 1和pH 14处理，检测结果说明粗提液的抑菌活性仍然存在，说明拮抗物质具有较广的pH耐受能力。

2.3 粗提物活性成分分析

2.3.1 红外光谱扫描分析 参考胡皆汉等人编写的《实用红外光谱学》对图谱进行分析[4]，从图7可以看出，在3430.0、2962.1、1639.5、1455.7、1407.8、1331.6、1246.2、1080.3、1038.2 cm-1有吸收峰，其中在其特征频率区波数1639.5、2962.1 cm-1表示分子中可能含有羧基和α，β-不饱和内酯结构，3430.0 cm-1可能是O-H伸缩振动峰，1038.2 cm-1可能是C-H苯环1、3、5取代峰，1331.6、1246.2 cm-1可能是C=O伸缩振动峰(也可能是C=C振动峰)，1455.7和1407.8 cm-1可能是C=H面内弯曲振动峰，919.9 cm-1可能是-CH2面外变形振动峰，875.5 cm-1可能是=C-H振动峰，840.8 cm-1可能是-C-H面外变形振动峰。

图6 拮抗提取物的酸碱稳定性Fig.6 The stability of extractive on different pH

图7 拮抗物质红外吸收光谱Fig.7 IR spectrum of the antibiotics production

2.3.2 气相色谱质谱联用仪检测拮抗物质成分 由图8分析可知，样品中含有脂肪酸、斑蝥素、5-乙酰基四氢呋喃-2-酮、3-甲基-6-异丙基-2,5-哌嗪二酮、环(甘氨酰基亮氨酸)、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、脯氨酸环二肽、3,6-二(甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮、吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、酚嗪等成分。

在培养基中检测出的多种物质中，与样品中具有相同类别的成分为六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮、3,6-二(甲基丙基)-2,5-哌嗪二酮和吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮，并且前两者含量和样品中的相差不大，因此判断样品中的这两种物质由于不被菌株生长所转化，在样品中继续检出，是培养基中所含有而非菌株生长代谢产物；样品中检出的吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮和脯氨酸环二肽的含量低于培养基中，判断是菌株生长中部分转化利用了该物质，检出的为剩余部分，因此该物质也非菌株生长代谢产物；培养基中检出的、但没有在样品中检测出的其它类物质推断为被菌株在生长过程中转化利用了，培养基和样品中各检出成分及含量如表2所示。

综上所述，GC-MS扫描分析揭示出样品所含的成分为脂肪酸、斑蝥素、5-乙酰基四氢呋喃-2-酮、3-甲基-6-异丙基-2,5-哌嗪二酮、环(甘氨酰基亮氨酸)、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、酚嗪等成分。其中含量最高的前3类物质为: 11.99 %的N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、6.02 %脂肪酸和3.69 %的酚嗪，其它几类物质的含量相对较低。

图8 GC-MS检测培养基(a)和样品(b)中的成分Fig.8 Components of control and sample on GC-MS

3 讨 论

分析结果表明，拮抗物质不能被供试的多数有机溶剂萃取，只有乙酸乙酯能部分萃取出活性成分。已有的研究报道说明，乙酸乙酯可作为多种植物的病原拮抗菌活性成分的萃取有机溶剂[5-7]，说明多种植物的病原拮抗菌活性成分具有和乙酸乙酯相似的极性。

菌株MT-002-B-7的粗提液抑菌活性对蛋白酶不敏感，由此推断粗提物中可能不含有蛋白质成分。通过红外光谱和GC-MS成分扫描分析可知，拮抗物质中可能含有脂肪酸、斑蝥素、5-乙酰基四氢呋喃-2-酮、3-甲基-6-异丙基-2,5-哌嗪二酮、环(甘氨酰基亮氨酸)、N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、酚嗪等成分。其中红外光谱图中1639.5 cm-1是仲胺类NH弯(面内)弯曲振动峰，是脯氨酸环二肽或者甘氨酰基亮氨酸的特征峰，1331、1246、1080.3、1038.2 cm-1是叔胺类C-N振动峰(1350～1020 cm-1)；1639.5 cm-1应该是1-酮基-2羟基(或氨基)芳酮，是N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4，3，0]-壬烷-2,5-二酮的特征峰；1407.8 cm-1为羟基面内弯曲振动的峰(1440～1375 cm-1)，是脂肪酸的特征峰；1246.2 cm-1为结晶性长链脂肪酸固相特征峰。因此，进一步结合GC-MS扫描成分含量比例，认为拮抗物质主要为N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、脂肪酸和酚嗪。陈亮等的研究结果表明，抑制烟草青枯病的活性成分主要为环二肽-(酪氨酸-亮氨酸)[8]，该成分与本研究分析所得的环(甘氨酰基亮氨酸)具有相似的结构模式，都具有2个氨基酸组成的环二肽。而其它关于烟草青枯病拮抗菌中活性成分分析的研究报道较少，易有金[9]张秀玉[10]测出拮抗物质的大概分子量，董昆明的研究结果表明拮抗烟草青枯病原菌的活性成分是由13种不同的化合物组成的混合物，但未确定13种化合物成分[11]。

表2 通过GC-MS检测出的培养基和样品中所含的物质

但本研究中由于乙酸乙酯不能完全萃取吸附发酵液的活性物质，可能导致红外光谱和GC-MS检测出的物质有遗漏。另外GC-MS分析时，粗提物中是否所有的活性物质都被气化检出，其中被检出的各种物质是否能单独或协同抑制烟草青枯病原菌都有待更多的研究来分析和验证。

4 结 论

(1)结果表明菌株MT-002-B-7的拮抗活性物质和乙酸乙酯的极性相似，具有一定的热稳定性，对蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶不敏感，抑菌活性不受保存时间的影响。但当8w紫外线照射的时间超过8 h，pH<5和pH>8的条件会显著降低粗提物的抑菌活性。

(2)结合分析红外光谱结果和GC-MS检测结果，初步认为拮抗物质中主要的成分是N-乙酰-3-甲基-1,4-二氮杂双环[4.3.0]-壬烷-2,5-二酮、脂肪酸、酚嗪、斑蝥素、5-乙酰基四氢呋喃-2-酮、3-甲基-6-异丙基-2,5-哌嗪二酮、环(甘氨酰基亮氨酸)等成分，其中前3种含量最高，分别是11.99 %、6.02 %和3.69 %，其它几类物质的含量相对较小。