烤烟成熟期烟叶木质素代谢和保水性变化及其相关分析

高娅北，王廷贤，郑小雨，白金莹，周中宇，赵东方，赵贵斌，邱 坤,*

(1.河南农业大学烟草学院,河南 郑州 450002；2.福建省烟草公司南平市公司,福建 南平 353000；3.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450016；4.贵州省黔东南州烟草公司，贵州 凯里 556000)

【研究意义】烟叶保水力是活体烟叶对水分保持能力的固有属性，其主要通过含氮类化合物与水分的结合紧密程度来实现的[1]，对烘烤过程中烟叶干燥具有重要作用。但烘烤过程中烟叶水分干燥主要包括水分迁移和叶表扩散[2]，其中木质素是烟叶水分输导组织的主要组成部分，对提高烟叶叶内水分迁移有效运输效率，协调烟叶水分散失等具有重要意义。【前人研究进展】木质素可使木质部细胞壁产生疏水性，从而提高植物叶片维管束的水分有效运输，使细胞不易脱水从而提高植物叶片的水分保持能力[3-4]，因此，植物叶片木质素含量对植物叶片保水性有重要意义。目前，关于烟草木质素的研究多集中在测定方法研究以及卷烟原料的含量调控等方面[5-6]，而叶片木质素对植物叶片保水能力的影响在多种作物上已经得到了广泛研究：木质素含量增加，玉米叶片的保水能力增强[7]；随着蒙古扁桃叶片中合成木质素的关键酶活性的增强，其叶片相对含水量也增大，保水能力提高[8]；将调控木质素合成的关键转录因子在拟南芥中过表达后，可明显提高其叶片的保水能力[9]。【本研究切入点】烤烟幼苗在干旱胁迫下，木质素含量以及PAL、C4H、4CL、CAD酶活性会有明显的上升趋势从而调节其生命活动[10]，但目前关于成熟过程中的烤烟木质素代谢以及保水性的研究尚缺乏系统的研究，且对于造成不同烤烟品种间烟叶木质素含量差异的生理基础尚不明确。【拟解决的关键问题】因此，本研究以保水力不同的3个烤烟品种为试验材料，研究其中部叶木质素含量及木质素代谢关键酶活性、烟叶保水力和相对含水量的变化规律，探讨木质素含量变化与烤烟叶片保水性的关系，从而为烤烟品种选育以及优质烟叶生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

于2017年在河南省洛阳市洛宁县烟草科技示范基地进行。采用漂浮育苗的方式进行育苗，挑选生长整齐一致的壮苗移栽至盆中种植，行距120 cm，株距50 cm，每盆植烟1株。每盆装土10 kg，供试土壤有机质8.30 g/kg、全氮0.90 g/kg、速效氮65.12 mg/kg、速效磷24.22 mg/kg、速效钾107.21 mg/kg，pH=7.81) 。每盆烟株N、P2O5、K2O的施入量分别为 0.12、0.12、0.36 g/kg，肥料分别在移栽当天(移栽日期：2017年5月11日)、移栽后第1和2周分3次施入，肥量比例为2∶1∶1。现蕾期打顶(日期：2017年7月16日)，每株留叶数均为18片叶，其他管理措施均按照优质烟叶生产技术规程进行，每个品种每次重复种植50盆。

供试烤烟品种参照林杰[11]、汪志威[12]和马新蕾等[13]的研究进行筛选，分别为K326(保水性强)、秦烟96(保水性中等)和中烟100(保水性较弱)。在打顶后0、10、20、30、40和50 d进行取样，每小区采集生长情况正常且一致的烤烟中部叶(10～12叶位)10片，一部分在采后立即放入液氮中速冻，于-70 ℃冰箱中进行保存备用，其他用于烟叶保水力、相对含水量指标的测定，测定重复3次。

1.2 木质素含量测定方法

现将新鲜烟叶样品采用采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，将干燥后的样品磨碎过60目筛，而后采用孔浩辉等[14]的NaOH/尿素低温溶解法进行烟叶木质素含量的测定。

1.3 木质素代谢相关酶活性测定方法

苯丙氨酸转氨酶(PAL)活性采用张志良等[15]的方法进行测定；肉桂酸4-羟化酶(C4H)活性采用Lamb等[16]的方法进行测定；4-香豆酰CoA连接酶(4CL)活性采用陈晓光等[17]的方法进行测定；香豆酸3-羟化酶(C3H)活性采用上海邦奕生物科技有限公司生产的酶联免疫分析试剂盒进行测定；肉桂醇脱氢酶(CAD)活性采用Morrison等[18]的方法进行测定。

1.4 烟叶保水力和相对含水量的测定方法

烟叶保水力(WRC)采用符新妍等[19]的方法进行测定；相对含水量(RWC)的测定先将烟叶表面水分用吸水纸吸干，而后称取其鲜重D1，而后将烟叶浸泡至双蒸水中直至其水分饱和，称取其饱和鲜重D2，然后利用烘箱法将烟叶烘干至恒重，称取其干重D3，根据公式RWC%=(D1-D3)/(D2-D3) ×100 %进行计算[20]。

1.5 数据分析

运用Microsoft Excel 2010进行试验结果统计，运用Origin 2017进行绘图，运用SPSS 22进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同品种烤烟生长过程中木质素含量的变化

由图1可见，各品种烟叶在烟株打顶后的生长发育过程中木质素含量变化规律基本一致，都表现出先缓慢增加直至打顶后40 d烟叶木质素含量达到其最大值，而后迅速降低至一较低水平的变化趋势。其中，中烟100烟叶木质素含量在打顶后各时期均小于其他两品种，K326在打顶时烟叶木质素含量低于秦烟96，而后含量快速增加高于秦烟96，在打顶30 d后，其烟叶木质素含量降低幅度较大，在打顶后50 d时含量低于秦烟96。

图1 不同烤烟品种木质素含量的变化Fig.1 Changes of lignin content in different flue-cured tobacco varieties

2.2 不同烤烟品种生长过程中保水力及相对含水量比较

由表1可见，各品种烤烟烟叶保水力随生长发育时间的增加，呈现先增加后降低的变化规律，说明随着烟叶成熟，其保水力也逐渐提高，而随烟叶成熟期的延长其保水力又逐渐下降。各品种间烟叶保水力相比，表现为K326>秦烟96>中烟100。其中，在打顶当天和打顶后10 d K326保水力显著高于中烟100，在打顶后30和50 d中烟100保水力显著低于其他2品种，说明K326和秦烟96相比中烟100烟叶保水力较强，叶片不易失水。

由表2可见，各品种烤烟烟叶相对含水量随生长发育时间的增加，呈现先增加后降低的变化规律，说明烟叶相对含水量随烟株逐渐成熟也逐渐提高，而烟叶过熟会使烟叶相对含水量降低。各品种间烟叶相对含水量相比，表现为K326>秦烟96>中烟100。其中，在打顶当天、打顶后10 d和打顶后40 d K326保水力显著高于中烟100，在打顶后50 d中烟100保水力显著低于其他两品种，说明K326和秦烟96相比中烟100烟叶相对含水量较高，其烟叶在生长发育期间的水分亏缺程度较低，在土壤水分供应与其自身蒸腾作用平衡性较好，保水能力较高。

因此，在打顶后各品种烟叶保水力及相对含水量与木质素含量的变化规律相一致，表明烤烟叶片木质素含量高，其保水能力强。

2.3 不同品种烤烟生长过程中木质素合成关键酶活性的变化

由图2A可见，随烤烟生长发育进程，各品种烤烟烟叶的PAL活性呈先增加后降低的变化趋势，在打顶后40 d各品种烟叶PAL活性达到最高值。其中，中烟100和秦烟96在达到活性最高值之前都呈现出缓慢上升的变化规律，而K326在此期间变化幅度较大，在打顶10 d后PAL活性迅速升高，明显高于其他两品种；在打顶40 d后，秦烟96和K326烟叶PAL活性迅速降低，而中烟100活性变化不明显。可见在打顶后烟叶生长发育过程中除个别时期，各品种间PAL活性基本表现为K326>秦烟96>中烟100，表明保水能力强的烤烟品种其烟叶PAL活性强且活性反应迅速，有利于木质素的合成并为其合成提供保障。

表1 不同烤烟品种生长过程中保水力的变化

注：同一行检测指标不同字母表示在0.05水平上存在显著差异，下同。

Note: Different letters of the same line indicate significant differences at the 0.05 level. The same as below.

表2 不同烤烟品种生长过程中相对含水量的变化

图2 不同烤烟品种木质素合成相关酶活性变化Fig.2 Changes of lignin synthesis-related enzyme activities in different flue-cured tobacco varieties

由图2B可见，各品种烟叶C4H活性在生长发育过程中变化趋势保持一致，都呈现出在打顶后活性先降低，在打顶后10 d开始增加直至打顶后30 d活性达到最大值，而后活性迅速下降的变化规律，其中在生长发育过程中的各个时期各品种间C4H活性均表现为K326>秦烟96>中烟100，说明保水能力强的烤烟品种C4H活性较高，对木质素的合成有利。

由图2C可见，各品种烟叶4CL活性在生长发育过程中总体呈现出先降低后升高再降低的变化规律。其中中烟100在各时期活性均低于其他两品种；而秦烟96和K326在打顶后20 d之前活性差别不大，随后K326活性在打顶后30 d达到最大值且高于秦烟96，然后活性降低；秦烟96在打顶10 d后4CL活性一直缓慢升高直至打顶后40 d达到最大值，此时活性高于其他两品种，随后降低。因此在烟叶成熟(打顶后30 d)前，各品种烟叶4CL活性表现为K326>秦烟96>中烟100，成熟后表现为秦烟96>K326>中烟100这可能与4CL的催化产物进入其他次生物质代谢途径有关。

由图2D可见，各品种烟叶C3H活性在生长发育过程中总体呈现先逐渐降低直至打顶后30 d达到最低值而后升高的变化规律，在烟叶成熟期后各品种活性趋于一致，这可能与其在烟叶的生长发育过程中参与到多种次生物质的代谢有关。其中，中烟100和秦烟96烟叶C3H活性变化趋势较为一致，而K326在打顶后20 d内C3H活性下降较慢之后活性迅速降低，因此在打顶后10～20 d各品种烟叶C3H活性表现为K326>秦烟96>中烟100，除此之外基本表现为秦烟96> K326 >中烟100，说明烟叶在成熟以前，保水能力强的品种C3H活性也较高，且变化波动较不明显，有利于木质素合成。

由图2E可见，各品种烟叶CAD活性在生长发育过程中总体呈现先升高至打顶后30 d达到最大值而后降低的变化规律，其中在打顶后各品种烟叶CAD活性略有降低可能是由于打顶对烟叶内生理生化变化造成一定影响引起的。各品种间相比，中烟100在发育过程中各时期活性均低于其他两品种，且变化幅度较小；K326在打顶后20 d内活性均略低于秦烟96，但在成熟期活性迅速增强高于秦烟96，说明保水能力强的烤烟品种CAD对环境条件较为敏感且酶活性强应答速度较快，有利于木质素的合成以应对环境条件变化。

表3 烤烟叶片木质素含量及相关酶活性与耐旱能力相关分析

注：*表示5 %水平差异显著，**表示1 %水平差异显著。

2.4 烤烟木质素含量及相关酶活性与保水能力相关分析

由表3分析表明，烤烟中部叶木质素含量与烟叶保水力和相对含水率呈显著正相关。表明烟叶木质素含量与烟叶保水能力密切相关，木质素含量高，烟叶保水能力强。木质素含量分别与PAL、C4H和CAD活性呈显著正相关(相关系数分别为0.78、0.81和0.77)；与4CL、C3H活性相关不显著。表明烟叶PAL、C4H和CAD活性的提高是木质素含量增加的酶学基础。

2.5 PAL、C4H、4CL、C3H、CAD活性与木质素含量的回归分析

为明确影响烤烟中部叶木质素含量的关键酶及其差别，综合烤烟中部叶的PAL(x1)、C4H(x2)、4CL(x3)、C3H(x4)和CAD(x5)活性对木质素含量建立回归方程y=0.614x1+0.374x2-0.6x3+0.457x4+0.658x5(R2=0.666)。表明5种木质素合成相关酶类与烤烟中部叶木质素含量之间存在线性关系，各酶类对木质素含量的影响为CAD>PAL>4CL> C3H>C4H。表明烤烟中部叶的木质素合成受CAD和PAL活性的影响最大。

3 讨 论

3.1 烟叶木质素含量与其保水能力的关系

木质素与纤维素和其他糖类结合在一起，作为细胞壁的填充物质，可强化植物叶片细胞壁，其含量与植物在不同环境条件下的水分散失情况密切相关[21]。在水分供应不足时，植物木质素含量迅速升高以应对不利的环境条件，随着植物木质化程度加深，细胞壁增厚，其内部组织水分散失受到限制，保水能力提高以保证植物的正常生长[22]。徐宇强等[23]认为叶片木质素含量高的玉米品种，其保水能力较强，在土壤缺水情况下可维持其正常的生理活动。本研究结果表明，与中烟100相比，秦烟96和K326的烟叶保水力强、相对含水量高，保持叶片水分平衡的能力强，其中部叶木质素含量在烟株生长发育过程中始终保持较高的水平，尤其在打顶后的烟叶质量形成的重要阶段木质素含量迅速积累。相关分析表明，烟叶木质素含量与烟叶保水力和相对含水量呈显著正相关(R=0.76、0.86，P<0.05)。说明保水能力强的品种在打顶后烟叶成熟期木质素含量提高快，木质素含量高。由此推断，烟叶木质素含量可作为衡量烤烟保水能力高低的一个评价指标。

3.2 木质素合成相关酶活性与烤烟保水能力的关系

PAL是木质素合成时苯丙氨酸合成途径中的第一个酶[24]，下一步C4H控制肉桂酸向香豆酸的转化[25]，随后4CL催化羟基肉桂酰辅酶A脂的合成[26]，最后CAD催化肉桂醇的衍生物向其对应的醇转化[27]，这些酶都是烟草及多种植物木质素合成的关键酶，在植物的抗性形成中发挥重要作用[28]。研究表明，PAL活性降低时，植物叶片木质素含量也降低，而当其活性增强时，植物叶片木质素含量明显增加[29]。本研究结果表明，烤烟叶片木质素含量及相对含水量与PAL活性呈显著正相关，PAL活性增强，烤烟叶片木质素含量增加；与中烟100相比，秦烟96和K326中部叶PAL酶活性较高。可见，PAL活性与烤烟保水能力密切相关。本研究发现，保水力强的品种其C4H活性高，说明C4H活性在一定程度上也可以反映烤烟的保水能力。CAD是合成木质素的最后一步反应的关键限速酶[30]。本研究表明，烟叶CAD活性与叶片木质素含量呈显著正相关与相对含水量呈极显著正相关，说明CAD活性也能在一定程度上反映出烤烟的保水能力高低。

5种酶活性与木质素含量的回归分析表明，烤烟中部叶的PAL和CAD活性是影响烟叶木质素合成的关键酶。烟叶具有较强的PAL和CAD活性是烤烟保水能力强的原因之一。

4 结 论

K326和秦烟96烟叶叶片保水力和相对含水量较高，其烟叶内木质素含量也相对较高，保持叶片中的水分动态平衡能力较强。烟叶木质素含量高低可以作为评判烤烟品种保水能力强弱的一个指标。较强的PAL和CAD活性是烟株保水能力增强的重要原因之一。