甲硫氨酸亚砜还原酶A高通量活性筛选体系的建立

杨加伟，彭辽天，程小玲

（遵义医科大学a.生物化学教研室；b.细胞生物学教研室，贵州遵义563006）

甲硫氨酸亚砜还原酶（Msr）是催化游离或多肽链中的甲硫氨酸亚砜（Met-O）还原为甲硫氨酸（Met）的一类酶[1，2]。目前报道的Msr可分为三类[3-4]：MsrA、MsrB和fRMsr，其中MsrB和fRMsr分别选择性还原多肽链中的-Met-O和游离的-Met-O；而MsrA则选择性的还原游离或者多肽链中构型的Met-O。手性亚砜是一类含有亚硫酰基（>S=O）官能团的重要有机化合物，是很多药物如质子泵抑制剂埃索美拉唑、血小板粘附抑制剂OPC-29030、钾通道激活剂Aprikalim等的关键组成部分[5-8]。利用生物酶选择性地合成单一构型的手性亚砜是目前的研究热点，但高对映选择性、高活性和高底物耐受的生物酶依然十分匮乏[9-11]。在本论文的前期工作中，项目组从一株假单胞菌中筛选出了一个MsrA基因并命名为MsrA[11，12]。利用MsrA重组蛋白为催化剂，有效实现了在底物浓度高达200mM下-构型亚砜的高特异性合成，且产率接近理论最佳值[13]，展现出了良好的应用前景。但是，该酶还存在底物谱较窄，酶促反应受底物的限制较大等不足，需要对酶进行改造和优化[13]。

定向进化是通过对蛋白质编码基因进行易错PCR、DNA改组、定点饱和突变等方法进行连续的随机突变、重组并通过高通量筛选方法获得期望酶突变体的一种技术。定向进化技术作为改造酶分子的有效策略，现已广泛应用在工业、环境以及医药等相关生物酶分子的改造领域[14-16]。由于定向进化技术需要对突变体库进行大量的筛选，所以实现对酶定向进化改造的首要步骤就是建立起该酶的高通量活性筛选体系。因此，本研究基于前期研究结果及进一步研究的需要，拟建立一种高通量的MsrA的活性筛选体系，为其定向进化改造奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.2 方法

1.2.1 细菌培养与蛋白表达

1.2.2 重组菌细胞裂

1.2.3 MsrA活性测定应混合液于96孔酶标版，加入195L显色液（50mM磷酸缓冲液，pH8.0，2mMDTNB），静置于37℃反应30min后，用酶标仪测定各个样品孔在412nm处的光吸收。以不含MsrA重组蛋白的细菌裂解液为空白对照，用空白对照与样品OD412的差值衡量MsrA重组蛋白的活性。

1.2.4 数据分析

利用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。利用独立样本T检验法计算两个样品间的差异显著性，<0.05表示有统计学意义并用星号（*）标示。差异系数（coefficientofvariation)的计算方式为一组数据的标准差与其均值的百分比。

2 结果

2.1 MsrA基因工程菌微量培养体系的建立

因需要进行大规模的筛选，本研究首先需建立一种适用于96孔培养板的 MsrA基因工程菌培养和表达体系。经过反复摸索，本研究选用单孔容积为2mL的96孔培养板，培养基最终体积为1mL。为减少不同培养孔中由于细菌生长差异而导致的酶量差异，本研究先使用小体积的培养基培养细菌使其达到饱和。向每个培养孔中加入少量的LB培养基（0.3mL），将含MsrA重组质粒的菌株单克隆依次挑取至各个培养孔中。37℃培养12h后，再加入大量（0.7mL）含诱导剂（IPTG）的新鲜培养基，诱导重组蛋白表达。结果显示，经过24h的诱导培养，每个培养孔中细菌的生长状态良好，且差异较小。吸取一定量的菌液置于酶标仪进行OD600测量，结果显示每个培养孔测得的OD600值差异较小（图1），经统计分析，所有样品的差异系数仅为8.0%。结果表明各个培养孔中的细菌生长一致性较好，成功建立了MsrA重组基因工程菌的微量培养体系。

图1 96孔培养板细菌生长分析。虚线表示所有样品的平均值

2.2 MsrA活性检测体系的优化

图2 DTNB-DTT显色法检测MsrA重组蛋白酶活性。n=5，*表示与对照相比有统计学差异（<0.01）。

2.3 MsrA高通量活性筛选体系的确立

图3 MsrA重组蛋白酶活性高通量检测分析。虚线表示所有样品的平均值

图4 MsrA酶活性高通量筛选体系示意图

3 讨论

定向进化技术是对生物酶进行改造以提升其催化性能的有效手段，通过向模板序列中导入随机突变，结合高通量筛选技术获得期望的突变体[18]。和另一种常用的蛋白质改造手段理性设计相比，定向进化技术特别适合于对结构与功能了解较少的蛋白质进行改造。理论上，通过大量反复的突变和筛选，任何蛋白质都有可能得到进化和优化。但在实际操作中，对大量突变体样本的筛选往往是此项研究工作的基础和瓶颈[19-21]。因此，建立合适的高通量活性筛选体系是利用定向进化技术对蛋白质进行改造的基础。

本课题组前期通过一系列的筛选与优化，获得了能高效制备手性亚砜的生物酶MsrA[13]，课题组接下来需对该酶进行定向进化改造以进一步提升其催化性能，为其将来的工业化应用打下基础。由于前期对MsrA酶活性的筛选主要是利用气相色谱及高效液相色谱法检测底物的消耗量或者产物的生产量[13]，耗时且效率低，不能满足高通量大规模筛选的要求.。因此课题组便开展了MsrA酶活性高通量筛选体系的研究。根据文献报导[17]，MsrA反应体系中的DTT随反应的进行而被消耗，由于DTT可和另一种物质DTNB反应生成黄色的化合物，该化合物在412nm处有最大光吸收。因此，测定反应液在OD412处的光吸收变化情况，即可反映MsrA酶的催化活性。由于文献中使用的是浓度较高的MsrA纯酶，并不确定是否适用于MsrA粗酶液。特别是本研究的微量培养体系中，MsrA酶的含量非常低。因此，本研究在该方法基础上进行了进一步的摸索和优化。通过优化重组菌株的培养方法以及显色反应体系，最终借助酶标仪，实现了MsrA酶活性的高通量筛选。最终结果显示，本研究测得不同培养孔中MsrA酶活性的一致性较好，能满足后续酶定向进化改造研究的高通量筛选需求。

综上所述，本研究成功建立了适用于定向进化改造的MsrA酶活性高通量筛选体系。