色谱质谱技术结合主成分分析鉴别庐山云雾茶真伪

刘 晔 徐春晖 王远兴

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

“匡庐奇秀甲天下，云雾醇香益寿年”的庐山云雾茶宛若碧玉，味似龙井而更醇香，色如沱茶却更清淡，是绿茶中的珍品[1]。庐山云雾茶保护区范围大，茶场分散，市场规范难度大，大量非原产地的庐山云雾茶以低廉的价格扰乱市场，真正产自保护区范围内的庐山云雾茶得不到有效保护，这对庐山云雾茶的销售价格及市场声誉均有较大影响。

指纹图谱可以鉴别真实性，评价质量一致性和产品稳定性，具有整体性和模糊性的特点，能够较全面地反映多种化合物的内在作用关系，通过与模式识别技术相结合，可有效提取有效信息[2]。红外光谱法、HPLC、GC、GC-MS 和液-质谱联用法（LC-MS）等方法均能生成指纹图谱[3-5]。

HPLC 技术分离性能高，稳定性好，可有效分析检测食品中多种化学成分，己被广泛应用到食品指纹图谱构建的研究中。它能够结合多种检测器，比如紫外检测器、二极管阵列检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。Xie 等[6]釆用LC-MS技术建立了不同基因类型和不同部位的绞股蓝样品的黄酮类化合物指纹图谱，PCA 能够取得较好的分类结果。

GC 或GC-MS 技术具有高灵敏度和高选择性，可以很好的分离、鉴定和定性化合物的特性[7]。李万春等[8]采用衍生化GC-MS 方法，对福建省安溪县境内8 个乡镇的铁观音及3 个乌龙茶品种通过化学计量学对数据进行处理、建模，确定茶叶的品种及产地，PCA 结果表明安溪县境内不同乡镇的铁观音表型有明显差异，相邻乡镇的茶叶代谢表型相似，为辨别安溪铁观音真伪奠定了基础。王丽鸳等[9]利用多元化学指纹图谱方法对杭州、丽水和新昌3 个地区9 类扁形绿茶产品进行判别分析，结果表明，同一品种不同产地或同一产地不同品种绿茶样本指纹图谱间存在显著差异。

本文将庐山云雾茶水溶性成分和挥发性成分作为研究对象，分别采用HPLC 和GC-MS 分析技术对庐山云雾茶和测试样本的成分进行探讨，获得庐山云雾茶的指纹图谱数据并得到各成分的相对峰面积，然后利用PCA 对相对峰面积进行处理，研究结果可对庐山云雾茶的真伪识别提供一定参考。

1 试验部分

1.1 样品与试剂

供试庐山云雾茶，通远镇（S1-S5）庐山茶科所茶场；赛阳镇（S6-S9），庐山露语茶业有限公司；星子县（S10-S12），星子县庐山七尖云雾茶有限公司，以及庐山市本地、市面上采买的8 个茶叶样本（S13-S20）。供试品均采于2016年5月份，样品放置于4 ℃冰箱中保存。

甲醇（色谱纯），德国Merck 公司；甲酸（色谱纯），ROE 公司；水，屈臣氏蒸馏水；表没食子儿茶素（HPLC≧94%）、咖啡因（HPLC≧99%）、芹菜素（HPLC≧96%）、芦丁（HPLC≧92%）、表儿茶素没食子酸酯（HPLC≧95%），中国食品药品鉴定研究院。

1.2 仪器与设备

Agilent1290 超高相液相色谱仪（四元泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD 检测器）、Eclipse Plus-C 18 column （4.6 mm×100 mm，3.5 μm）、Agilent GC- QQQ 7890/7000A 三重串联四极杆气质联用仪、HP-5 MS 石英弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美国Agilent 公司；萃取纤维头50/30 μm DVB/ CAR/ PDMS，美国Supelco 公司；AL104 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ5200E 型超声波清洗器，机械昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A 型离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 样品预处理

1.3.1 水溶性成分的提取 将茶叶粉碎过筛，精确称取1.00 g 粉末并加入50 mL 超纯水，超声10 min，80 ℃水浴30 min，置于离心机中5 000 r/min离心15 min，将上清液用0.22 μm 水系滤膜过滤，得到茶叶水溶性成分。

1.3.2 挥发性成分的提取 将茶叶粉碎过筛，精确称取2.00 g 粉末于20 mL 顶空萃取瓶中，立即用含隔垫盖子密封；将顶空瓶置于80 ℃水浴锅中水浴平衡30 min，每隔10 min 晃动瓶身；再将固相萃取头插入顶空萃取瓶中，萃取吸附30 min[10]。萃取结束后将萃取头放入GC-MS 进样口中，250℃解析5 min，以检测茶叶挥发性成分。

1.4 色谱和质谱条件

1.4.1 HPLC 条件 流动相：以0.1%甲酸水溶液为流动相A 和甲醇为流动相B 进行梯度洗脱，梯度洗脱：0～15 min：5%～20%（B）；15～35 min：20%～45%（B）；35～40 min：45%～5%（B）。二级管阵列检测器（DAD）波长：254 nm；柱温：30 ℃；流速：0.6 mL/min；进样量：5 μL。

1.4.2 GC-MS 条件 色谱条件：色谱柱：HP-5 MS 石英毛细柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：起始柱温50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min 升至80 ℃，然后以2 ℃/min 升至140 ℃，最后以5 ℃/min 升至210 ℃保持5 min；载气为高纯氦气（纯度≥99.999%）；载气流速为1 mL/min；进样口温度250 ℃；分流比为10∶1。

质谱条件：电子轰击离子源；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度为150 ℃；溶剂延迟1 min；质量扫描方式为全扫描；质量扫描范围m/z 40～400。

1.5 数据分析

水溶性成分通过HPLC，利用中国药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”进行数据处理，将所得的色谱图进行比较，得到可以全面反映多个色谱图特征的庐山云雾茶对照指纹图谱，得到共有峰，将其共有峰时间居中的峰作为参照峰，并以参照峰的峰面积为分母，各共有峰的峰面积为分子，求得其相对峰面积。利用SIMCA-P 13.0 版软件对数据进行主成分分析。

挥发性成分通过GC-MS 检测得到总离子流图，根据NIST MS Search 2.0 质谱图库检索结果，并结合保留指数文献值对庐山云雾茶挥发性成分进行初步筛查鉴定。以样本挥发性物质的相对峰面积为变量，将数据导入SIMCA-P 13.0 版软件，将数据标准化后进行无监督的主成分分析。

2 结果与分析

2.1 液相指纹图谱的方法学考察

2.1.1 精密度试验 随机抽取同一批次的庐山云雾茶样品，1 d 内连续进样6 次，考察色谱峰的相对保留时间、相对峰面积的一致性。结果表明，其色谱峰的相对保留时间和峰面积的比值基本没有变化，各共有峰相对保留时间RSD≦0.52%，相对峰面积RSD≦2.47%，表明仪器精密度良好。

2.1.2 重现性试验 随机抽取同一批次的庐山云雾茶样品，平行制备6 份测试液，比较其相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD≦1.02%，相对峰面积RSD≦2.81%，表明该测定具有良好的重现性。

2.1.3 稳定性试验 取同一批次的庐山云雾茶水样品，分别在制备后的24 h 内每隔4 h 进样1 次，比较色谱峰的相对保留时间、相对峰面积。结果表明，各共有峰相对保留时间RSD≦0.95%，相对峰面积RSD≦1.86%，表明所制备的样液在24 h 内稳定性良好。

2.2 庐山云雾茶水溶性成分

2.2.1 HPLC 指纹图谱的构建 将S1-S20 茶叶样品按1.3.1 节的方法制备样液，在1.4.1 节色谱条件下进行测定，得到所有水提茶叶样本的HPLC图。经过中药色谱指纹图谱相似度评价系统处理，获得其液相对照指纹图谱R 见图1（横坐标为时间，min，纵坐标为所获信号，mV），并建立20 批庐山云雾茶的指纹图谱，见图3。将没食子儿茶素、咖啡因、芹菜素、芦丁、表儿茶素没食子酸酯5 个标准品。每个取2 mg 加超纯水溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，制成单标。用0.22 μm 水系滤膜过滤，在1.4.1 节色谱条件下进行测定，确定每个标准品的出峰时间。再将混标在相同的条件下进行测定，结果如图2所示。编号1～5 分别是没食子儿茶素、咖啡因、芹菜素、芦丁、表儿茶素没食子酸酯，这个5 个峰分别对应图1中C15，C20，C21，C32 和C36。

图1 庐山云雾茶的对照指纹图谱Fig.1 Reference fingerprint of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

图2 5 种混标的高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of five kinds of mixed standards samples

图3 20 批庐山云雾茶的液相指纹图谱Fig.3 HPLC fingerprints of 20 batches of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

相似度作为中药指纹图谱的评价参数，可以最大限度的避免主观因素影响，以实现对指纹图谱整体相似性的客观评价。对照指纹图谱R 与20批茶叶样品相似度进行比较，结果见表1。相似度值越接近1，它们越相似。由表1可知，所有茶叶样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度都在0.93以上，符合指纹图谱要求，因此可以较全面地反映庐山云雾茶指纹图谱的相似关系。同时也表明所测样品间的组分具有很强的相似性，各组间成分较为一致。

表1 20 批庐山云雾茶液相指纹图谱间的相似度Table 1 The similarity of fingerprints from 20 batches of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

表2 庐山云雾茶液相指纹图谱共有峰的相对峰面积Table 2 The relative peak areas of the HPLC fingerprints of common peaks in Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

（续表2）

表3 测试茶样液相指纹图谱共有峰的相对峰面积Table 3 The relative peak areas of the HPLC fingerprints of common peaks of tested samples

（续表3）

将茶叶样本水溶性成分相对峰面积数据导入SIMCA 软件，拟合3 个主成分，第1 主成分特征值为8.37，贡献率41.9%，第2 主成分特征值为4.31，贡献率为21.6%，累积方差贡献率为63.5%，第3 主成分特征值为3.64，贡献率18.2%，累积方差贡献率为81.7%。3 个主成分已包含绝大多数信息，可说明数据的变化趋势[11-12]。利用主成分分析可实现对数据的降维处理，简化数据，同时保留数据最重要的方面，方便进行样品之间相似性和差异性的分析。坐标的绝对值越大，对该成分的贡献越大。不同茶叶样本之间的距离表示其差异的大小。以第1 主成分为x 轴，第2 主成分为y 轴得到庐山云雾茶水溶性成分主成分分析图，见图4。

图4 庐山云雾茶样本水溶性成分的主成分二维得分图（a）和二维载荷图（b）Fig.4 PCA 2D score plots （a） and loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on water soluble active components

由图4可以看出，大部分庐山云雾茶样本都汇聚在y 轴的右边，而S18、S19 和S20 茶叶样本远离汇聚区域，零散分布在y 轴的左边。其中图4a中样本S19 和载荷图中化合物芹菜素（C21）、C24、C33 位置类似，说明这些含量呈正相关，结合表2、表3可知，在S19 样本中芹菜素（30.66%）、C24（1.79%）和C33（0.56%）3 个化合物含量比其它样本都要高很多。表明这些化合物是区分S19和真正庐山云雾茶的关键变量。图4a 中样本S18、S20 和 图4b 中 化 合 物C3、C16、C17、咖 啡 因（C20）、C22、C28、C30、芦丁（C32）、C34 位置类似。这些化合物远离y 轴，说明这些含量呈正相关，S18 较S20 距离y 轴更远，表示这些化合物含量更高。结合表2、表3可知，S18 和S20 中这些化合物的含量要远高于其它庐山云雾茶样本。如C16：S18（5.20%）>S20（3.53%）>其它样本；C17：S18（1.85%）>S20（1.15%）>其它样本；咖啡因：S18（32.51%）>S20（27.32%）>其它样本；芦丁：S18（3.94%）>S20 （3.12%）>其它样本；C34：S18（7.01%）>S20（5.25%）>其它样本。表明这些化合物是区分S18、S20 和真正庐山云雾茶样本的关键变量。而C10、C11、C12、C14、表没食子儿茶素（C15）、表儿茶素没食子酸酯（C36）等化合物与S18、S19、S20 位置相反，说明这些物质的含量呈负相关，结合表2、表3可知，S18、S19、S20 中这些化合物的含量要远低于其它样本，如表没食子儿茶素含量：其它样本>S20（3.81%>S19（3.55%）>S18 （1.24%）；表儿茶素没食子酸酯：其它样本>S19（1.93%）>S20（1.55%）>S18（0.90%）。

综合而言，8 个测试茶叶样本中S13、S14、S15、S16、S17 为庐山云雾茶样本，S18、S19、S20 为非庐山云雾茶样本。HPLC 技术结合PCA 结果表明，所有样本均能正确识别真伪，判别率为100%。

2.3 庐山云雾茶挥发性成分

2.3.1 GC-MS 指纹图谱的构建 将S1-S20 茶叶样品按1.3.2 节方法制备样液，在1.4.2 节色谱条件下进行测定，得到所有茶叶样本的GC-MS 总离子流图。获得其典型的庐山云雾茶挥发性成分指纹图谱，见图5a。并建立20 批庐山云雾茶的挥发性成分指纹图谱，见图5b。

图5 庐山云雾茶挥发性成分指纹图谱Fig.5 Fingerprint of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components

由图3、图5b 中可以看出，庐山云雾茶样品的GC-MS 指纹图谱的差异性比HPLC 指纹图谱大得多，挥发性成分峰的个数较水溶性成分更多，为方便统计分析，选择了38 种含量较高的挥发性物质作为研究对象。保留指数主要指物质在固定液上的保留值行为，与色谱分析中的很多参数和条件无关，故结合文献中的保留指数，这些挥发性成分可以得到初步鉴定。表4为庐山云雾茶挥发性成分定性分析结果。由表5、表6可知，各成分的色谱峰的相对峰面积有较大差异，说明其挥发性物质成分差别较大，这可能是由于庐山云雾茶等级、产地、采摘时间等条件影响导致。

2.3.2 主成分分析 将茶叶样本挥发性成分相对峰面积数据导入SIMCA 软件，拟合3 个主成分，第1 主成分特征值为8.62，贡献率43.1%，第2 主成分特征值为4.98，贡献率为24.9%，累积方差贡献率为68.0%，第3 主成分特征值为3.15，贡献率15.8%，前3 个成分的累计方差贡献率已经达到83.8%。以第1 主成分为x 轴，第2 主成分为y 轴得到庐山云雾茶样本挥发性成分主成分分析图，见图6。

不同的变量对区分模型的建立和贡献是不一样的。从理论上讲，越是远离中心点的变量，对得分图的贡献也就越大，而这种物质正是不同类型样本中的差异成分[33]。由图6a 得分图可以看出，a区域分布在x 轴的上部分，b 区域分布在x 轴的下部分，c 区域分布在y 轴的右边，已知3 个产地的庐山云雾茶能够相对分开，区域各产地样本均处于相对独立的空间。而通过液相色谱得到的数据无法做到这样的区分。图6a 得分图表示不同茶叶样品挥发性成分含量的相似性和差异性，图6b 载荷图则能找出引起这些样品差异的关键变量。结

合表5、表6可知，载荷图中萘（C18）、3-甲基十一烷（C19）、十二烷（C22）、α-柏木烯（C29）、石竹烯（C30）、雪松醇（C36）等挥发性成分与a 区域（S1、S2、S3、S4、S5）位置相似，说明这些化合物含量较高，是区分a 区域的关键变量。如化合物3-甲基十一烷：S1（0.50%）>S2（0.40%）> S5（0.35%）>S3（0.34%）>S4（0.27%）>S11（0.20%）>S12（0.19%）>S6（0.14%）>S10（0.11%）>S9（0.06%）>S8（0.01%）=S7（0.01%）。载荷图中己醛（C2）、吲哚（C24）、十四烷（C28）、α-衣兰油烯（C32）、十六烷（C37）等挥发性成分与b 区域（S6、S7、S8、S9）位置相似，这些化合物含量高，是区分b 区域的关键变量。如化合物α-衣兰油烯：S6（3.05%）> S9（2.26%）>S8（1.69%）>S7（1.55%）>S1（0.27%）>S5（0.26%）>S2（0.24%）=S4（0.24%）>S10（0.23%）>S3（0.16%）>S12（0.15%）>S11（0.11%）。化合物茉莉酮（C27）远离y 轴，与c区域（S10、S11、S12）位置类似，表明含量较a、b 区域高：S11（2.11%）> S10（2.01%）>S12（1.53%）>S4（1.48%）>S6（1.35%）>S5（1.10%）>S9（1.08%）>S2（0.91%）>S7（0.64%）=S8（0.64%）>S1（0.55%）>S3（0.35%）。由图6a 可以看出，S18、S19、S20 茶叶样本远离庐山云雾茶样品范围，特别是S18 和S20 茶叶样本距离其它样本更远。图6b 中的1-辛烯-3-醇（C8）、2-正戊基呋喃（C9）、马鞭草烯酮（C21）、β-紫罗酮（C31）、δ-毕澄茄烯（C34）等化合物与S18、S19 和S20 位置类似，含量呈正相关，是区别庐山云雾茶真伪的关键变量。如马鞭草烯酮：S18（2.88%）> S20（2.83%）> S19（1.09%）> 其它样品；如β-紫罗酮：S18（8.96%）> S20（6.55%）>S19（5.16%）>其它样品。

表4 庐山云雾茶挥发性成分定性分析结果Table 4 Qualitative analysis of volatile components in Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples

表5 庐山云雾茶挥发性成分相对峰面积Table 5 The relative peak areas of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components

表6 测试茶样挥发性成分相对峰面积Table 6 The relative peak areas of tested tea samples on volatile components

综合而言，8 个测试茶叶样本中S13、S14、S15、S16、S17 为庐山云雾茶样本，S18、S19、S20 为非庐山云雾茶样本。利用GC-MS 技术结合PCA均能正确识别真伪，判别率为100%。

图6 庐山云雾茶样本挥发性成分的主成分二维得分图（a）和二维载荷图（b）Fig.6 PCA 2D score plots （a） and 2D loading plots （b） of Lu Mountain Clouds-Mist Tea samples on volatile components

3 结论

本试验采用HPLC 技术检测庐山云雾茶水溶性成分，并得到相应的指纹图谱，通过方法学考察和相似度计算，说明建立的指纹图谱可以较为全面的反映庐山云雾茶的特征，同时利用主成分分析得到前3 个主成分累积贡献率分别为81.7%，其中得分图可以较好的识别庐山云雾茶的真伪，判别率达100%。采用GC-MS 技术检测庐山云雾茶挥发性成分，38 个挥发性成分得到初步鉴定。将挥发性成分相对峰面积进行主成分分析，前3个主成分累计贡献率为83.8%，其中得分图较精准识别庐山云雾茶的真伪，判别率达100%。结果表明，利用色谱质谱技术结合主成分分析可以较为精准的识别庐山云雾茶的真伪。今后可以尝试如LC-MS[34]、近红外光谱法[35]等检测技术，以期为庐山云雾茶产地、品种、等级或香型的识别方面，提供一种简便快速的方法。