顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用和气相色谱嗅闻技术鉴定清香型白酒特征香气物质

冒德寿 牛云蔚 姚征民 肖 晴 肖作兵* 马 宁 朱建才

（1 云南中烟工业有限责任公司技术中心 昆明650231 2 上海应用技术大学 上海201418 3 上海海洋大学 上海201306）

中国白酒，也被称为白酒或烧酒，是一种在全世界享有盛名的蒸馏酒，尤其是在中国。通常乙醇含量在40%～55%[1]。中国白酒按传统的香型主要可分为：清香型、浓香型、酱香型、米香型和其它香型（如凤香型、兼香型）。不同香型的白酒，具有不同的风格特点[2]。其中，清香型白酒因其果香和花香宜人而深受广大消费者喜爱，尤其在中国北方地区人们更加偏爱清香型白酒。众所周知，白酒的品质取决于许多因素，如原料和发酵过程等。此外，清香型白酒的香气也是产品质量的一个重要因素。对于研究人员来说，掌握清香型白酒中的重要香气化合物对提升香气品质至关重要。

近年来，固相微萃取技术（SPME）和气相色谱-嗅觉测量技术（GC-O）广泛应用于白酒中的香气化合物的定性、定量，研究人员通过这些技术对清香型白酒中的关键香气化合物进行了初步探索。丁云连[3]通过浸入式固相微萃取（DI-SPME）与气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）鉴定出汾酒中的苯乙醛、4-乙基愈创木酚、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、β-苯乙醇、辛酸乙酯、乙酸乙酯、3-甲基丁醇、2-甲基丙醇和1-辛醇这10 种香气物质，初步作为特征香气物质。杜艳红等[4]采用DI-SPME 从红星二锅头原酒中共鉴定出138 种风味物质。张恩[5]应用顶空固相微萃取（HS-SPME）结合AEDA（芳香化合物萃取稀释法）发现洋河新酒与老酒中重要风味化合物为己酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯。高文俊等[6]应用HS-SPME、液液微萃取结合气相色谱-质谱及气相色谱-氢火焰离子化检测技术对清香型青稞酒进行研究，共分析定量了69 种香气成分，并结合香气活力值（OAV）得到青稞酒中最重要的香气成分为3-甲基丁醛。随后，又对3种清香型白酒采用香气重组和遗漏试验验证酒中酯类的重要性[7]。姜晓坤等[8]采用HS-SPME 萃取同山高粱酒中的香气成分，从传统同山高粱酒中检测到35 种香气成分，其中主要香气成分为乙酸乙酯、3-甲基丁醇、丁酸乙酯、己酸乙酯。王志娟等[9]优化HS-SPME 条件萃取竹叶青酒中的香气物质，分离得到65 种香气化合物。柯苑[10]通过HS-SPME-GC-MS 技术对台湾金门高粱酒鉴定出46 种成分，并得出酯类化合物对香气有重要贡献。大部分研究工作主要集中对单一品牌清香型白酒的香气成分进行分析，而对多种清香型白酒的特征香气成分研究较少，并且对5 种典型清香型白酒的研究报道更是罕见。

数理统计分析探究白酒香气物质之间的作用规律是深入研究白酒特征香气的重要拓展之一，多元统计分析是研究客观事物中多个因素（或多个变量）之间相互关系的方法，如单因素方差分析[11]，主成分分析[12]，偏最小二乘回归[13-14]。张莉等[15]利用系统聚类方法提出一种结合理化性质来减少白酒品评中主观因素的新方法。Camara 等[16]将葡萄酒的组分分类后进行主成分分析，并逐步剔除掉干扰变量，将主成分得分与变量载荷对应作图，直观展现葡萄酒种类与物质之间的关系。马燕红等[17]运用多元线性回归和偏最小二乘法，建立一个白酒组成与其酒龄的相关模型，所建立的数学模型具有良好的稳定性和预测能力，可实现清香型白酒酒龄的预测。邵燕等[18]通过建立多元回归模型，分析基础酒酒骨架成分与感官评分之间的相关性，为浓香型白酒的感官评价提供了较为科学的理论基础。牛云蔚[19]用PLSR 方法研究了不同发酵工艺参数对特征香气物质和特征呈味物质形成的贡献，并找出各个发酵参数与某些特征香气物质和呈味物质的相关性。然而，多元统计分析在清香型白酒中的运用较少，利用偏最小二乘法研究清香型白酒中香气物质作用规律鲜见报道。

本文主要研究：1） 通过感官分析来描述不同产地清香型白酒的香韵特征；2）定性、定量分析重要香气化合物；3）通过PLSR 探究白酒样品，感官属性以及重要香气化合物之间的相关性。

1 材料和方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 白酒 来自不同地区的5 种典型清香型白酒：国色清香（清香型，体积分数53%，河南宝丰酒业有限公司）、红星二锅头酒（清香型，体积分数53%，北京红星股份有限公司）、杏花村世家（清香型，体积分数53%，山西杏花村汾酒集团有限公司）、汾酒（清香型，体积分数53%vol，山西杏花村汾酒集团有限公司）、金门高粱酒（清香型，体积分数58%，台湾金门酒厂宝业股份有限公司）。所有酒样（每瓶500 mL）均来自对应的合作酿酒厂，并在4 ℃下贮藏。

1.1.2 试剂 氯化钠、无水乙醇、标准品、内标（2-辛醇，400 mg/L）、正构烷烃C7～C30，美国Sigma 上海分公司。

1.1.3 仪器 气相色谱质谱联用仪 （GC7890AMS5975C），美国Agilent 公司；碳分子筛-二乙烯基苯-聚二甲基硅氧烷（CAR/DVB/PDMS，50/30 μm）萃取头，美国Supelco 公司；HH-2 型水浴锅，国华电器有限公司；ODP2 嗅闻仪，德国Gerstel 公司。

1.2 测试方法

1.2.1 顶空固相微萃取 将固相微萃取头在气相色谱仪的进样口经250 ℃老化15 min 备用；准确移取白酒样品5 mL 于20 mL 螺口顶空瓶中，并加入1 g 氯化钠和20 μL 内标2-辛醇。使用带隔垫的铝盖密封，于50 ℃恒温水浴锅中加热平衡5 min。然后将固相微萃取装置的针头穿透隔垫插入顶空瓶内上方，固定好固相微萃取的手柄，小心推出纤维头并开始计时，吸附45 min 后取出，随即插入GC-MS 仪器的进样口，在250 ℃温度下解吸5 min。

1.2.2 GC-MS 分析条件 GC 条件：毛细管色谱柱Agilent HP-INNOWAX （60 m×0.25 mm×0.25 μm）和DB-5（60 m×0.25 mm×0.25 μm），起始柱温为40 ℃，保持6 min，以3 ℃/min 升到100 ℃，然后以5 ℃/min 升到230 ℃，保持20 min；进样口温度250 ℃，检测器温度230 ℃；载气He，流速为1 mL/min，无分流进样。

MS 条件：电离方式为EV，电子能量70 eV，载气为He，灯丝发射电流为200 μA，离子源温度为250 ℃，接口温度为250 ℃，扫描质量范围为35～450 m/z。

1.2.3 GC-O 方法 嗅闻条件：ODP2 嗅闻仪的传输线温度250 ℃，气体为N2，接口温度为180 ℃。

1.2.4 定性与定量分析

1.2.4.1 定性分析 采用MS、保留指数（Retention index，RI）和嗅闻3 种方法进行结构鉴定。MS 是通过人工解析并使用计算机标准质谱库NIST05进行对照确定。RI 定性是按1.2.2 节GC 色谱条件下，通过对C7～C30正构烷烃的色谱扫描，计算得到各化合物的RI，并与相应标准品的RI 值进行比对，即可对物质进行有效定性分析。嗅闻是将评价员描述的化合物香味特征与文献报道对比。

1.2.4.2 定量分析 采用内标法对各化合物的浓度进行定量分析，将Osme value≥2 的香气物质的标准品配成混合溶液，并用无水乙醇定容。稀释7 个浓度梯度的混合溶液，在每个梯度中加入内标2-辛醇和氯化钠，用于定量分析。

1.2.5 感官评价 清香型白酒的香气特征由训练有素的小组评估，包括10 个成员（22～40 岁），4 个女性和6 个男性，所有感官人员属于实验室工作人员，并且在感官描述分析中具有长期经验。根据ISO 8589 标准感官分析方法[20-21]和GB/T 1010345-2007，5 次感官讨论会议，每次1.5 h。在3 次初步讨论会议中，小组成员彻底讨论了清香型白酒的香气特性和7 个属性（粮香、清香、酸香、甜香、果香、窖香、花香），这7 种感官属性所对应的标准参照物分别是：粮香对应糠醛，清香对应庚醛，酸香对应乙酸，甜香对应2，3，5，6-四甲基吡嗪，果香对应十二酸乙酯，窖香对应己酸乙酯，花香对应乙酸苯乙酯。

在第4 和第5 次会议中，要求小组成员在10点强度等级上以随机顺序对样品的感官属性进行评级（0= 不存在，1= 非常低，并且9= 非常高）。在20 ℃下，在50 mL 样品杯中评价恒定体积15 mL 的清香型白酒，样品杯被随机3 位数编码。在洁净的空气条件下，每次嗅闻间隙为20 s。

它使我们不断去消费自我预期的那个形象。“看起来富一点”。这不但赋予了他们社交的谈资，城市生活的安全感，更证明了他们的选择是有意义的，是正确的。

1.2.6 数据分析 方差分析：使用SPSSv13.0（SPSSInc.，Chicago，IL，USA）评价来自描述性分析的数据。进行Duncan 多重比较检验的方差分析以确定每个感觉属性的个体样品之间的差异。

偏最小二乘分析 （PLSR）：通过使用UNSCRAMBLERv9.8（CAMOASA，Oslo，Norway）探 讨清香型白酒样品，感官结果和香气化合物之间的关系。

2 结果与分析

2.1 5 种清香型白酒主要香气成分分析

应用顶空固相微萃取方法将清香型白酒中挥发性成分分离，并通过GC-MS 和GC-O 技术分析，在5 种清香型白酒中共鉴定出72 种香气化合物，包括酯类29 种，醇类13 种，醛类8 种，酮类6种，酸类3 种，烯烃类5 种，酚类3 种，其它类5种。

由于清香型白酒的特征主要是清和甜，清香型白酒在陈化和老熟阶段产生的香气物质大部分为酯类和醛类物质，酯类物质主要在发酵期间，是酵母或丝状真菌的代谢产物，通过脂肪酸酯化得来[22]，使得清香型白酒的果香气息透发。香气强度值高的主要集中在乙酯类化合物，其中乙酸乙酯（香气强度值≥3）、异戊酸乙酯（香气强度值≥3.5）、己酸乙酯（香气强度值≥3.83）、辛酸乙酯（香气强度值≥4）等。己酸乙酯（菠萝样香气）是果香香韵的典型代表，也是酱香型白酒和浓香型白酒中的重要酯类化合物[23]，因此在GC-O 嗅闻过程中容易嗅辨到。对于醛类物质来说，糠醛（杏仁气味和甜味）、壬醛、2-庚醛是在茅台酒中存在，构成香气轮廓的重要醛类物质[2]。

在醇类中，5 种清香型白酒中香气强度值较高的有异戊醇和β-苯乙醇，一般情况下，用于清香型白酒生产的主要原料是高粱、大麦和豌豆：前者用于制造酒，后两者用于制作曲[24]。高粱在发酵过程中产生的香气是酒中粮食香的体现，异戊醇（麦芽香气）在酒中作为粮食香气的典型代表。β-苯乙醇（玫瑰和蜂蜜香气）使得清香型白酒入口有甜的感觉。还有一些其它的研究工作报道1-戊醇、1-庚醇、2-庚醇和1-辛醇对白酒中的果香香气有贡献[23]。

酮类香气化合物通常来自发酵过程中的脂质和氨基酸的降解，并且它们对食物气味具有高度影响[25]。宋波[26]在分析白酒中各种成分对白酒的影响时，指出丁二酮是白酒中不可缺少的成分，在优质白酒中含量一般为5～15 mg/100 mL，可增加香气，有甜感，增加醇厚感。酸类物质是形成酯类物质的前提，它对各香气成分起协调、平衡作用，增加醇厚感；是新酒老熟的有效催化剂；对香味有抑制和掩蔽作用。异戊酸，己酸和癸酸在清香型白酒中被鉴定，其中己酸被报道对浓香型白酒有助香作用[26]。其它文献中报道异戊酸和己酸对白酒中的奶酪香气有贡献[27]。

范文来等[7]总结近些年清香型白酒的研究报道，发现β-大马士酮、土味素等也是重要的香气化合物，其中β-大马士酮（蜂蜜和花香香气）虽然

表1 5 种清香型白酒中香气化合物的GC-O 鉴定Table 1 Aroma compounds identified by gas chromatography-olfactometry in five light aroma-type liquors

（续表1）

2.2 香气物质的定量分析和香气活力值分析

由表2可知，采用建立标准曲线的方法对表1中香气强度值≥2 的35 种香气化合物进行定量分析。在这些香气化合物中，乙酸乙酯在之前很多的研究中被认为是白酒中含量最高的物质。在国家标准中[31]，乙酸乙酯在优级的清香型白酒中的含量大于1 g/L。在本次研究中，乙酸乙酯含量最高与之前的报道一致。其次，异戊醇在清香型白酒中浓度位居第2，由于发酵过程中，产生大量的异戊醇，另外，己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯以及异丁醇的含量也较高（1～100 mg/L）。同时，十六酸乙酯（97 mg/L）在金门高粱酒中有的浓度较高，而在其它4 种清香型白酒中未检测出。β-大马士酮（0.8～47.3 μg/L）在白酒中是痕量物质，然而并不是含量越低，该物质对酒的整体香气贡献度就越小，该物质的香气阈值大小也是重要因素之一，因此，基于这两方面考虑，香气活力值（OAV）的引入成为衡量某种香气物质对整体香气贡献度大小的重要指标。一般来说[33]，OAV 值≥1 的香气物质被认为是重要的香气物质。

由表3可知，由于β-大马士酮的香气阈值为0.12 μg/L，虽然定量浓度很小，但是它对于酒的整体香气贡献度依然排在前面，这与文献报道的一致[7]。共有18 种香气化合物的OAV 值≥1，这些物质是酒中重要的香气化合物。辛酸乙酯（白兰地香气）、己酸乙酯（菠萝样香气）、异戊醛（令人愉快的果-香香气）这3 种香气化合物的OAV 值最高，均大于100，异戊醛（OAV 57-2929）具有青草香和麦芽香，被认为是青稞酒中重要的香气化合物之一[6]，含量虽然不到乙酸乙酯的十分之一，但是由于其较低的阈值（16.51 μg/L），所以在酒中的整体风味贡献度大。并且己酸乙酯也是浓香型白酒种的特征香气化合物[23]。辛酸乙酯（OAV=4 523）和己酸乙酯（OAV=2 041）在杏花村酒中贡献度最大，因此杏花村酒被认为是中国清香型白酒的代表。

2.3 感官评价分析

由表4的Duncan 多重比较分析可知，酸香和清香香韵在5 种酒中差异性极其显著（P＜0.001）。国色清香酒在酸香和花香香韵中得分最低，而它的窖香香韵突出；红星二锅头酒在粮香和清香中得分最低，而在酸香方面突出，因此在感官评测中香气较为醇厚；杏花村和汾酒由于出自同一个地区，因此这两种白酒大体相似，在甜香和果香方面得分最高，因此这两种酒在嗅闻上比其它的酒偏果香和甜；金门高粱酒在粮香和清香香韵上得分很高，金门高粱酒来自台湾金门酒厂，可能由于当地的高粱与内陆的高粱品种不同，导致金门高粱酒在粮香上有突出表现，因此金门高粱酒香气更偏清香和粮食的香气。

2.4 样品、感官属性和香气物质的相关性分析

PLSR 用于处理由小组成员的感官评价累积的平均值，气味活性芳香化合物和样品之间的相关性。X 代表白酒的香气化合物；Y 代表感官变量和样本。包括两个重要主成分的PLSR 模型解释了交叉验证方差的70%（图1）。结果表明，PLSR模型中的最优组分数量被确定为两个主要组分。PC2 对PC3 结果没有在这里呈现，因为没有提供超出PC1-PC2 的有用相关性信息。图中的小椭圆和大椭圆分别代表该模型50%和100%的解释方差，从图1可以看出，除了酸香和窖香两个感官属性外，其余感官属性变量均分布在两个椭圆之间。

通过PLSR 回归分析，将样品、感官属性及香气物质相关联，由图1可知，国色清香与窖香香韵有相关性，并且国色清香与β-大马士酮（56）呈现相关性；红星二锅头酒与酸香香韵相关性较好，这与感官分析（表4）得到的结果相一致；杏花村酒和金门高粱酒与花香香韵和粮香香韵具有相关性，而花香和粮香香韵分别与异丁酸乙酯（3）、己酸乙酯（10）和辛酸乙酯（15）；汾酒与甜香、果香香韵相关，而且汾酒与异戊醇 （33）、苯丙酸乙酯（25）、壬醛（47）、乙酸苯乙酯（23）具有较好的相关性，这4 种香气化合物也被认为是汾酒中的重要香气化合物质[3]。

表2 5 种清香型白酒中香气物质的标准曲线和质量浓度Table 2 Standard curves and mass concentrations of odorants in five light aroma-type liquors

表3 5 种清香型白酒中香气化合物的阈值和香气活力值Table 3 Thresholds and OAVs of aroma compounds in five light aroma type Chinese liquors

图1 清香型白酒样品、感官属性与香气化合物之间的相关性分析Fig.1 Correlation loading plot for samples，sensor evaluation and aroma compounds

3 结论

1） 通过HS-SPME-GC-MS 和GC-O 鉴定出72 种香气化合物，其中35 种为活性香气化合物（香气强度值≥2）。清香型白酒中香气物质共分为8 类，包括酯类、醇类、醛类、酸类、酚类、酮类、烯烃类和其它类。

2） 通过建立标准曲线法对这35 种香气活性化合物进行定量分析，并结合OAV 计算，35 种香气活性化合物中有18 种物质OAV≥1。香气强度评分≥2，且OAV≥1 的18 个香气活性化合物按照OAV 值从大到小依次排序：辛酸乙酯、异戊醛、己酸乙酯、异戊酸乙酯、β-大马士酮、乙酸乙酯、癸酸乙酯、丁酸乙酯、壬醛、乙酸异戊酯、异丁酸乙酯、苯丙酸乙酯、戊酸乙酯、4-乙基愈创木酚、苯乙醛、异戊醇、异丁醇、乙酸苯乙酯、壬酸乙酯。OAV值高的香气物质为清香型白酒整体香味贡献出粮香、果香、花香、甜香等，它们综合组成了清香型白酒的独特香型特征。

3） 通过PLSR 相关性分析得到国色清香与清香香韵具有相关性，国色清香与窖香香韵有相关性，并且国色清香与β-大马士酮呈相关性；红星二锅头酒与酸香香韵相关性较好；杏花村酒和金门高粱酒与花香香韵和粮香香韵具有相关性，而花香和粮香香韵分别与异丁酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯；汾酒与甜香、果香香韵相关，而且汾酒与异戊醇、苯丙酸乙酯、壬醛、乙酸苯乙酯具有较好的相关性。