超声功率对胰蛋白酶的酶活性与结构变化的影响

黄姗芬 马海乐 杨 雪 王禹程 赵丽霞 李云亮

（江苏大学食品与生物工程学院 江苏镇江212013）

胰蛋白酶是一种动物体内非常重要的肠道消化酶，胰蛋白酶由223 个氨基酸残基组成，相对分子质量23 800，极易溶于水，不溶于有机溶剂，适宜pH 7.5～8.0，适宜温度37～40 ℃，是一种丝氨酸蛋白酶。胰蛋白酶具有高度专一性，能特异性切割赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸的羧基末端形成的肽键。经X-射线晶体学发现胰蛋白酶分子由两个大小几乎相等的结构域组成，其中每个结构域由6 个反平行的氨基酸链组成，主要的二级结构单元为β-折叠[1]。胰蛋白酶的氨基酸序列含有6 个二硫键，活性位点氨基酸包括His 46 和Ser 183[2]。胰蛋白酶作为一种优质的蛋白水解酶，被广泛应用于食品、生物和医药等领域[3-4]。胰蛋白酶的热稳定性差，使其应用受到一定限制。

目前已有大量文献通过固定化技术、化学修饰和动态高压微射流技术等来提高蛋白酶的热稳定性[5-15]。超声波是声源振动频率大于20 kHz 的机械波。超声波由于频率高，波长短，因此其空化作用效率高，能量大，穿透力强。超声波技术被广泛应用于食品、化工和生物等领域[16-17]。近年来，将超声波技术应用于蛋白结构改性已成为新的研究热点[18-21]。然而，通过超声波技术处理蛋白酶，对其酶学性质、中间体状态及其结构变化的研究鲜见报道。

本文主要研究超声功率对胰蛋白酶活性、热稳定性、酶促反应动力学和热力学参数的影响，采用红外光谱、荧光光谱和紫外光谱分析研究不同超声功率处理的胰蛋白酶结构变化与酶活性之间的关系，通过荧光相图法发现和表征超声功率诱导胰蛋白酶变性过程中的中间体，为扩大胰蛋白酶工业化应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胰蛋白酶，美国sigma 公司；酪蛋白，国药集团化学试剂有限公司；L-酪氨酸、盐酸、氢氧化钠、三氯乙酸、无水碳酸钠、福林酚试剂等均为分析纯。

1.2 主要试验仪器

GA92-IIDB 型超声波细胞破碎机，无锡上佳生物技术有限公司；Tecan Infinite PRO TWIN 200 酶标仪，瑞士帝肯公司；Cary Eclipse 荧光分光光度仪，美国瓦里安公司；Nicolet IS50 傅立叶变换红外光谱仪，美国尼高力仪器公司；UV-1601微量紫外分光光度计，北京瑞利分析仪器公司。

1.3 试验方法

1.3.1 试剂配制 胰蛋白酶缓冲溶液：1 mmol/L的HCl，内含0.01 mol/L CaCl2。

Tris-HCl 溶液（pH 7.5）：12.114 g Tris 用蒸馏水溶解，加盐酸调pH 7.5 后，定容至1 000 mL。

酪蛋白溶液：称取标准酪蛋白1.0000 g，用少量NaOH 溶液湿润后，加入80 mL Tris-HCl 溶液（pH 7.5），在沸水浴中加热煮沸30 min，并不断搅拌至完全溶解，冷却至室温，调pH 7.5 后，定容至100 mL。

胰蛋白酶溶液：称取胃蛋白酶0.5000 g，用胰蛋白酶缓冲溶液溶解，定容至500 mL，于4 ℃冰箱放置5 h，备用。

1.3.2 酶活测定方法 参照国家标准GB/T 23527-2009 测定蛋白酶活力[22]，稍作修改。先将1%的酪蛋白溶液于40 ℃水浴5 min。加稀释3.5倍的胰蛋白酶溶液0.5 mL，于40 ℃水浴2 min 后，加1%的酪蛋白溶液0.5 mL，混匀，然后在40 ℃下水浴反应10 min，结束后加入1.0 mL 三氯乙酸。空白先加三氯乙酸再加酪蛋白。静置10 min，12 000 r/min 离心5 min，取滤液30 L，碳酸钠溶液150 μL，福林酚试剂30 L，40 ℃恒温20 min，680 nm 下于酶标仪测吸光值。每个样品做3 次平行。

1.3.3 超声波对胰蛋白酶的处理方法 量取胰蛋白酶溶液48 mL，将超声波发生仪的探头置于溶液中，探头没过溶液2 cm，不接触溶液底部。超声参数∶间歇比（s）为3∶3，超声总时间5 min，超声功率范围（75～350 W），初始温度控制为25 ℃。超声预处理完毕后于4 ℃冰箱放置12 h，测其酶活、热稳定性、动力学、热力学、荧光光谱、紫外光谱和红外光谱。

1.3.4 超声波对胰蛋白酶热稳定性的处理方法将未处理的胰蛋白酶溶液与超声处理后的胰蛋白酶溶液置于水浴锅，温度分别为60，70，80 ℃下保温30 min，测定胰蛋白酶溶液剩余的酶活性。

1.3.5 超声波对胰蛋白酶动力学参数的影响

1.3.5.1 超声处理方法 超声处理胰蛋白酶溶液的方法参照1.3.3 节。

1.3.5.2 化学反应速率常数的计算 根据Kadkhodaee 等[23]报道的方法研究超声处理对胰蛋白酶动力学参数的影响。在反应过程中因为底物浓度较大，可以认为酪蛋白反应为一级反应，其一级化学反应动力学模型见下式：

由于反应物酪蛋白减少量不易测定，因此用产物酪氨酸生成量的变化来反映水解过程。定温定压下，反应t 时间时酪蛋白的浓度C 与潜在的酪氨酸的生成量成正比，潜在的酪氨酸的生成量为反应完全后酪氨酸的生成量（V∞）减去已经产生的酪氨酸（Vt），即C∝（V∞-Vt）。该式代入式（1）得：

式中，Vt——在时间t min 时酪氨酸的质量浓度（μg/mL）；V∞——酪蛋白彻底水解的酪氨酸的质量浓度（μg/mL），通过在pH 7.5、温度40 ℃的反应条件下酶解24 h 测得。

1.3.6 超声波对胰蛋白酶热力学参数的影响

1.3.6.1 胰蛋白酶的处理方法 超声处理胰蛋白酶溶液的方法参照1.3.3 节。超声处理后酶解温度分别是20，25，30，35，40 ℃。

1.3.6.2 活化能、活化焓、活化熵和活化吉布斯自由能的计算 根据贾俊强[24]的计算方法：

做“lnkin-”图为一条直线，由斜率可得表观活化能Ea。

1.3.7 肽键紫外吸收光谱 将超声处理好的胰蛋白酶溶液在25 ℃环境温度下，胰蛋白酶质量浓度1 mg/mL，采用紫外分光光度计测定为220 nm 波长紫外吸收值，以胰蛋白酶缓冲溶液作为空白光谱。

1.3.8 傅里叶变换红外光谱 将超声处理好的胰蛋白酶溶液在25 ℃环境温度下，胰蛋白酶质量浓度1 mg/mL，采用傅里叶变换红外光谱仪在波数4 000～400 cm-1范围内扫描，扫描条件：加样量0.10 mL，分辨率4 cm-1，扫描次数32 次。以空气的光谱为背景。经仪器自带的Omnic 软件对数据进行转换后，采用Peakfit 对酰胺Ⅰ带 （1 700～1 600 cm-1）进行解卷积和分峰、拟合，并对各子峰归属进行二级结构指认。

1.3.9 荧光相图法表征超声波诱导的中间体结构

荧光相图法的原理是不同试验条件下蛋白质结构会发生变化（去折叠/折叠），将发射波长分别为λ1和λ2时所测得的相应荧光强度I（λ1）对I（λ2）作图（称为荧光相图），由于荧光强度是一种与蛋白质的量成正比且具有加和性的广度性质，因此这两个变量间存在下列3 个关系式[25-26]：

在蛋白质折叠与去折叠的过程中，如果整个过程中蛋白质只存在完全折叠和完全去折叠结构，即“全或者无”，那么I（λ1）=a+bI（λ2），即I（λ1）与I（λ2）线性相关。如果整个结构变化过程中存在1 个或1 个以上的中间体，I（λ1）与I（λ2）是非线性相关的，且每1 条直线代表1个“全或者无”的结构变化。

图1 超声功率对胰蛋白酶活性的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on trypsin activity

超声处理之后的胰蛋白酶溶液稀释7 倍，用Cary Eclipse 荧光分光光度仪的激发波长295 nm，激发狭缝和发射狭缝10 nm，扫描范围300～400 nm，扫描速度1 200 nm/min。读取荧光发射光谱320 nm 和364 nm 的荧光强度I320和I364，然后以I320为横坐标，I364为纵坐标，用origin 作图，对散点进行线性拟合。λ1和λ2一般分别取320 和365[25-26]，由于仪器限制，λ2取364。

2 结果与分析

2.1 超声功率对胰蛋白酶活性的影响

胰蛋白酶活性随超声功率的变化曲线如图1所示。胰蛋白酶活性随着超声功率的增加出现波动现象。除了300 W 和350 W 时，其余超声功率对胰蛋白酶活性提高都有显著差异。其中在250 W 时，胰蛋白酶活性最高，依次是125 W 和175 W。酶活性比未超声处理的酶活性依次提高26.9%，25.3%和22.2%。

2.2 超声功率对胰蛋白酶热稳定性的影响

将经超声处理后的胰蛋白酶溶液在60，70，80 ℃中恒温保持30 min，再测定其酶活。由图2可知，超声后胰蛋白酶在60 ℃时的热稳定性，除了300 W，其余的超声功率处理后酶活残留率都比对照有明显降低（P＜0.05）。由图3可知，除了300 W和350 W，超声后的胰蛋白酶在70 ℃时的热稳定性与对照组无显著差异，其余的超声功率处理后酶活残留率都比对照组低（P＜0.05）。由图4可知，超声后的胰蛋白酶在80 ℃时热稳定性，300 W 和350 W 超声处理后的酶活分别提高了5.64%和19.19%（P＜0.01）。说明大超声功率对胰蛋白酶在70，80 ℃时的热稳定性促进作用更好。

图2 超声功率对胰蛋白酶热稳定性（60 ℃）的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on thermal stability of trypsin （60 ℃）

图3 超声功率对胰蛋白酶热稳定性（70 ℃）的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on thermal stability of trypsin （70 ℃）

2.3 超声功率对胰蛋白酶酶解反应动力学参数的影响

反应速率常数是化学动力学中一个重要的物理量，其数值直接反应了速率的快慢，反应速率常数越大，反应速率越快。速率常数与反应温度、反应介质和催化剂等有关。由图5可知，反应速率常数kin随着酶解温度的增加而逐渐上升。胰蛋白酶在20，30，40 ℃酶解时，75 W 超声处理后的反应速率常数分别比对照提高了13.50%，11.91%和8.02%。然而，胰蛋白酶在35 ℃酶解时，所有超声处理后的反应速率常数都与对照组相比无显著提高。整体来看，胰蛋白酶在低温条件下酶解时，75 W 超声处理对反应速率常数的促进作用最显著，反应速率最快。

2.4 超声功率对胰蛋白酶酶促反应热力学参数的影响

Ea 是基态反应物分子与过渡态之间的能量差，其决定反应速度。由表1可知，胰蛋白酶经不同超声功率处理后，125，150，200 W 时，Ea 都比对照低，200 W 时的Ea 最低，反应速度最快，比对照降低了21.32%。ΔH 是由一种状态变为另一种状态的过程中所吸收的热量。胰蛋白酶经不同超声功率处理后，100，125，150，200 W 时的ΔH 都比对照小，说明其反应所吸收的热量比对照少。其中150 W 和200 W 时的ΔH 比对照有极显著差异（P＜0.01），分别比对照降低了16.49%和15.05%。ΔS 是负值，表明活化络合物形成过程是有序性增加的过程。胰蛋白酶经不同超声功率处理后，100，125，150，200 W 时的ΔS 都比对照小，说明此状态的胰蛋白酶有序性比对照高。其中150 W 和200 W 时的ΔS 比对照有极显著差异（P＜0.01），分别比对照降低了12.94%和12.08%。ΔG 表示反应容易程度。75～250 W 时的ΔG 与对照无显著差异。300 W 和350 W 时的ΔG 比对照大，反应比对照更难进行。

图4 超声功率对胰蛋白酶热稳定性（80 ℃）的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on thermal stability of trypsin （80 ℃）

2.5 超声功率对胰蛋白酶结构的影响

2.5.1 超声功率对胰蛋白酶220 nm 紫外吸收光谱的影响 肽键的主要吸收峰在200～240 nm[27]，一般选取220 nm 的紫外吸收反映肽键含量的变化。超声功率对胰蛋白酶在220 nm 的紫外吸收光谱的影响如图6所示。

不同超声功率处理胰蛋白酶后，其在220 nm的紫外吸收值与未超声处理时相比，没有显著性差异（P＞0.05），说明胰蛋白酶肽键的含量并没有明显变化。

2.5.2 超声功率对胰蛋白酶傅立叶变换红外光谱的影响 傅里叶变换红外光谱反应蛋白质的二级结构变化，不受样品所处物理状态的影响。傅里叶变换红外光谱是分子振动光谱，主要分析酰胺Ⅰ带（1 700～1 600 cm-1）的C＝O 伸缩振动而吸收的红外光。查阅文献，根据“分子指纹”对蛋白质的二级结构进行指认以及分析计算[28-30]。β-折叠（1 610～1 640 cm-1，1 670～1 690 cm-1），α-螺 旋（1650～1 660 cm-1），无规则卷曲（1 640～1 650 cm-1），β-转角（1 660～1 670 cm-1，1 690～1 700 cm-1）。超声功率对胰蛋白酶二级结构的影响如表2所示。

从表2可以得出，超声功率对胰蛋白酶的二级结构具有显著影响。75，100，125，150，175 W 超声处理使胰蛋白酶的α-螺旋显著增加，与此同时β-折叠显著减少，无规则卷曲明显减少。然而，200，250，300，350 W 超声处理与未超声处理的β-折叠和无规则卷曲的含量没有明显差异。

图5 超声功率对胰蛋白酶反应速率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic power on trypsin reaction rate

图6 超声功率对胰蛋白酶的220 nm 紫外吸收的影响Fig.6 Effects of ultrasonic power on ultraviolet absorption of trypsin at 220 nm

表1 超声功率对胰蛋白酶热力学参数的影响Table 1 Effect of ultrasonic power on thermodynamic parameters of trypsin

表2 超声功率对胰蛋白酶二级结构含量的影响Table 2 Ultrasonic power on the secondary structure of trypsin content

2.6 超声功率诱导胰蛋白酶产生中间体结构

由图7可知，经超声功率诱导胰蛋白酶去折叠的荧光相图由2 条直线组成，交点出现在200 W。说明超声功率诱导的胰蛋白酶变性过程中存在1 个部分折叠的中间体，且这个中间体出现在在超声功率为200 W 时。

图7 超声功率诱导的胰蛋白酶去折叠的荧光相图Fig.7 Trypsin unfolding fluorescence phase diagram induced by ultrasonic power

3 结论

通过以上试验结果得出，超声波功率对胰蛋白酶活性的影响虽然出现波动现象，但整体来说，胰蛋白酶的活性随着超声功率的增加，先上升后下降。除300，350 W 之外，胰蛋白酶酶活性与对照相比有显著提高。在热稳定分析中，80 ℃处理后，在300，350 W 时的胰蛋白酶热稳定性显著提高，分别比对照提高了5.64%和19.19%。说明较大的超声功率对高温处理的胰蛋白酶热稳定性的促进作用更好。250，300 W 时，胰蛋白酶活性低而热稳定性高。其余超声功率胰蛋白酶活性高而热稳定性低。

在超声波对胰蛋白酶酶促反应动力学和热力学参数分析中，20 ℃酶解时75 W 对反应速率常数的促进作用最显著，比对照提高了13.50%。说明低温酶解时，低的超声强度对反应速率常数的促进作用更好。200 W 处理时胰蛋白酶的Ea 最小，即反应速率最快，比对照降低了21.32%。150，200 W 处理时胰蛋白酶的ΔH 和ΔS 与对照相比有显著差异，比对照分别降低了16.49%，15.05%，12.94%，12.08%。说明反应所吸收的热量少，胰蛋白酶的有序性高。75～250 W 处理时胰蛋白酶的ΔG 与对照无显著差异，即反应容易程度无明显改善。紫外光谱表明，超声波没有明显改变胰蛋白酶的肽键含量。红外光谱表明，超声波显著改变了胰蛋白酶的二级结构。荧光光谱发现超声波能诱导胰蛋白酶产生中间体，且中间体出现在200 W。中间体状态的胰蛋白酶的有序性高，同时具有高酶活和高反应速率。