徽州地区菊花的指纹图谱鉴别及其评价研究

徐苏丽，邢丽花，任 霞，史素影，刘玉梅，高广印，吕 胜，俞年军

(1. 黄山职业技术学院医学系，安徽 黄山 245000；2. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012；3. 安徽广印堂中药股份有限公司，安徽 亳州 236800；4. 安徽省旌德县人民医院，安徽 旌德 242600)

1 材料

1.1 药材 徽州地区菊花样品采自安徽省歙县、休宁县、旌德县、绩溪县，见表1，经安徽中医药大学俞年军教授鉴定为菊科植物菊(ChrysanthemummorifoliuRamat.)的干燥头状花序，其中包括贡菊、七月菊、金丝皇菊、黄菊。

1.2 仪器 Agilent 1260 Infinity Ⅱ 液相色谱仪(包括G7111A四元泵、G7129A自动进样器、G7114A紫外检测器)：美国Agilent公司；HH-4数显恒温水浴锅：江苏省金坛市晶玻实验仪器厂；AS系列超声清洗机：天津奥特赛恩斯仪器有限公司；竑力HL-200A型高速多功能打粉机：上海赛耐机械有限公司。

1.3 试剂 绿原酸(批号 11075-200413，纯度≥98%)、木犀草苷(批号 111720-201609，纯度>94.9%)、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸(批号 111782-201706，纯度>97.3%)：中国食品药品检定研究院。乙腈(色谱纯)：瑞典Oceanpak；纯化水：自制；磷酸(色谱纯)：天津永大化学试剂有限公司；其余所用试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Topsil HPLC C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～11 min，10%～12% B；11～13 min，12%～14% B；13～45 min，14%～18% B；45～46 min，18%～21% B；46～55 min，21%～24% B；55～80 min，24%～26% B；80～85 min，26%～45% B；85～90 min，45%～55% B；90～105 min，55%～10% B)，柱温30 ℃，流速1.0 mL/min，检测波长325 nm，进样量10 μL。

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液制备 分别精密称取绿原酸1.26 mg、木犀草苷1.23 mg、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸5.43 mg，置于50 mL容量瓶中，用75%甲醇定容，配制成25.2 μg/mL绿原酸、24.6 μg/mL木犀草苷、108.6 μg/mL 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 称取菊花样品粉末(过2号筛)1.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加入75%甲醇30 mL，水浴回流提取1.5 h，平行3次。合并滤液，浓缩，定容于50 mL容量瓶内，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取样品S1，供试品溶液按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，并记录液相色谱图，结果各共有峰相对保留时间的RSD≤1.39%，共有峰相对峰面积的RSD≤2.43%，表明仪器精密度良好。

两者舵的使用情况见图6和图7，可很直观地看出，使用指数函数修饰的控制器进行航向控制时，动舵幅度较模糊控制小很多，通过使用MATLAB进行计算可以得到，图6的平均舵角为1.94°，图7的平均舵角为2.27°，平均舵角下降了0.33°，降幅约为15%,而舵的使用情况在一定程度上可反映出船舶能量的消耗，以及船舶营运过程中船员的舒适感。所以,使用指数函数修饰的航向保持控制器，不仅能够降低能源的消耗，而且还在一定程度上改善船员的工作生活环境。

2.3.2 重复性试验 精密称取S1样品粉末6份，制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，结果各共有峰相对保留时间的RSD≤3.99%，共有峰相对峰面积的RSD≤4.77%，表明方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验 取S1样品粉末制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，分别在0、4、8、12、24、36 h进行检测。结果各共有峰相对保留时间的RSD≤4.25%，共有峰相对峰面积RSD≤3.98%，表明供试品溶液在36 h内稳定性良好。

2.4 徽州地区菊花样品指纹图谱的建立 取徽州地区20批菊花粉末(过2号筛)，精密称定，供试品溶液按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录液相色谱图。

2.4.1 共有峰的确定及指认 将20批徽州地区菊花样品色谱图AIA文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004版)，进行数据处理，设置S1为参照指纹图谱，多点校正匹配，筛选出12个共有峰，通过对照品比对可知，2号峰为绿原酸，4号峰为木犀草苷，7号峰为3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸。对照品图谱与样品图谱见图1，20批菊花样品指纹图谱重叠图见图2。

2.4.2 相似度分析 对实验得到的20批徽州地区菊花样品色谱图进行相似度评价分析，结果表明20批徽州地区菊花样品相似度均在0.701～0.997之间，不同品种的菊花相似度存在差异，其中S12、S17为金丝皇菊，与贡菊的相似度较低，均小于0.75。而同一品种不同产地的菊花相似度较高，S3、S13为贡菊，与贡菊之间的相似度较好，均大于0.98。见表2。

注：2.绿原酸；4.木犀草苷；7. 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸；其他峰对应的化学物质尚未被确定

图1混合对照品(A)、样品(B)的高效液相色谱图

注：2.绿原酸；4.木犀草苷；7. 3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸；其他峰对应的化学物质尚未被确定

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18S19S20S11S20.9921S30.9970.9911S40.9930.9850.9991S50.7820.7740.7690.7601S60.8400.8040.8420.8490.8981S70.7660.7360.7660.7720.9280.9821S80.8950.8690.9070.9170.8410.9750.9401S90.8690.8520.8680.8670.9630.9580.9520.9341S100.7990.7970.7890.7810.9970.8910.9170.8460.9651S110.8130.7930.8060.8020.9780.9520.9590.8990.9860.9731S120.7030.7020.6780.6610.9770.8100.8520.7250.9000.9700.9351S130.9990.9930.9960.9920.7970.8480.7770.8990.8810.8140.8280.7221S140.8850.8580.8930.9020.8630.9870.9580.9970.9450.8650.9180.7570.8901S150.9980.9860.9960.9920.7790.8420.7630.8930.8710.7970.8150.7010.9970.8821S160.8050.7840.7970.7920.9750.9420.9460.8830.9820.9700.9980.9380.8200.9030.8091S170.7340.7270.7180.7080.9960.8760.9170.8040.9430.9900.9690.9870.7510.8320.7310.9671S180.9870.9930.9870.9810.8040.8170.7540.8730.8760.8290.8190.7350.9900.8630.9840.8140.7581S190.9990.9880.9980.9950.7790.8440.7670.8990.8730.7970.8150.6980.9980.8880.9990.8090.7300.9871S200.9850.9940.9800.9710.8070.8060.7450.8580.8660.8300.8160.7500.9880.8510.9800.8100.7650.9920.9821

2.4.3 聚类分析 将20批徽州地区菊花样品的12个共有峰面积数据导入SPSS 23.0软件，采用质心聚类，欧氏距离平方法为度量标准，对菊花样品的高效液相色谱指纹图谱进行聚类分析，结果可知，将菊花样品分为两大类，S9(黄菊)聚为一大类，其他分为一大类，其中将S6、S7、S8、S14(七月菊)聚为一小类，S5、S12、S17(金丝皇菊)聚为一小类，将S1、S16(黄菊)聚为一小类，除S10外，其他样品(贡菊)分为一类。因此，聚类分析除S9、S10外，将贡菊、金丝皇菊、七月菊、黄菊分别聚为一类。其中贡菊与七月菊的亲缘关系距离较近，金丝皇菊与黄菊亲缘关系距离较近。具体见图3。

2.4.4 主成分分析 为全面评价20批徽州地区菊花样品质量，对12个共有峰进行主成分分析。运用共有峰面积数据分析软件，得出各共有峰方差贡献表，见表3。12个共有峰中得出3种主成分，第一主成分贡献率为38.61%，第二主成分贡献率为27.51%，第三主成分贡献率为16.28%，3种主成分累积贡献率达82.40%，即该3种主成分能够反映徽州地区菊花的基本信息。

图3 20批菊花样品的聚类分析树状图

为进一步确定徽州地区菊花药材的主成分，将20批菊花样品共有峰面积导入SIMCA-P(11.0)中，用PCA on X-block模型对样品进行主成分分析[12]。主成分得分见图4。由图可知20批菊花样品的主成分为4、8、11号峰，其中4号峰为木犀草苷，8、11号峰未知，需进一步实验研究。通过主成分分析PCA得分图(图5)可知，以4、8、11号峰3个主成分为指标成分进行得分分析，其中S1、S2、S3、S4、S13、S15、S18、S19、S20为一得分区，S6、S7、S8、S14(蓝色点)为一得分区，S5、S10、S11、S16、S17(红色点)为一得分区，其分类结果与聚类分析一致。

3 讨论

本实验对不同流动相、检测波长、洗脱比例、柱温等因素进行考察，结果确定乙腈-0.1%磷酸水为流动相，检测波长为325 nm，柱温为30 ℃，在该方法下色谱图分离度及峰形较好，响应值较好，此方法重复性、稳定性等均满足实验要求。采用相似度评价软件对20批徽州地区菊花样品指纹图谱进行分析，确定了12个共有峰，经对照品比对指认2号峰为绿原酸，4号峰为木犀草苷，7号峰为3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸。研究结果发现各批次样品之间相似度较大，其中不同产地贡菊样品间相似度较高，均大于0.98。这说明徽州其他地区的种植贡菊与传统核心产区歙县贡菊具有相同内在质量，因此，贡菊道地产区除歙县外，应该包括绩溪、休宁、旌德等相邻地区。这为满足市场需求，扩大种植面积，促进贡菊的产业发展提供了依据。

表3 20批菊花样品共有峰的总方差解释

图4 共有峰得分图

图5 20批菊花样品主成分分析得分图

聚类分析结果表明，除S9、S10外，将贡菊、金丝皇菊、七月菊、黄菊分别聚为一类。这说明徽州地区种植的不同品种菊花之间内在质量存在一定的差异，与黄菊、金丝皇菊相比，七月菊与贡菊的距离较近，七月菊是贡菊的人工栽培品[13]。因此，为保证道地药材贡菊的质量，种植应以原有贡菊品种为主体。

本实验建立的高效液相色谱指纹图谱方法能简单、快速地对徽州地区贡菊与其他菊花品种进行区分，为菊花的资源开发提供依据，也为徽州地区菊花的质量控制与品质评价提供初步的研究基础。