人凝血因子7a核酸适配体的筛选与鉴定

罗钰 王腾飞 李文静 王金娥 裴仁军

摘 要 人凝血因子7a （FVIIa）是外源性凝血途径的核心因子，检测参与凝血过程的FVIIa及针对FVIIa开发安全有效和经济的凝血剂和抗凝血剂是具有重要的意义。本研究基于指数富集配体系统进化技术 （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），采用酸纤维素膜法，通过11轮筛选成功分离出FVIIa的DNA适配体，并模拟了其二级结构。此适配体与FVIIa蛋白结合的表观解离常数为102 nmol/L。同时，基于所获得的高亲和力适配体，建立了基于适配体的荧光检测方法。本方法简单高效，对FVIIa蛋白的定量检测范围达到30～80 nmol/L，为人凝血因子7a的检测提供了一条新途径。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和适配体的荧光检测方法结果表明， 此适配体具有良好的选择性。

关键词 凝血因子7a; 适配体; 指数富集配体系统进化技术; 筛选; 荧光检测

1 引 言

经典凝血假说认为，在高等生命体中的凝血机制存在两个启动过程，分别是内源性凝血和外源性凝血 [1]。在正常的凝血过程及各种血栓性疾病中，凝血过程通过激活外源性途径触发。外源性凝血由凝血因子7a（Factor VIIa，FVIIa）与组织因子（Tissue factor，TF）形成的复合物引发[2，3]。FVIIa是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，在缺乏组织因子的情况下，对大分子底物的活性较低[4]。TF-FVIIa复合物的形成为大分子底物提供了一个合适的结合面，并通过改变FVIIa的活性位点提高其催化性能[5，6]。经过一系列反应，TF-FVIIa复合物通过外源性凝血途径最终促成纤维蛋白凝块的形成，参与凝血[7]。尽管此凝血途径的作用机制已被阐明，但现有技术对诊断和治疗由各凝血因子障碍而引起的血液疾病仍存在明显不足。因此，检测参与凝血过程的各因子，并针对特定疾病开发安全有效和低成本的凝血剂和抗凝血剂，仍然是一个亟待解决的问题。

适配体是通过指数富集配体系统进化技术 （Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX） 在體外筛选获得的一种单链核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，对其相应的靶标具有高亲和力和高选择性[8～11]。作为一种功能化核酸，适配体可用于对靶标分子的识别[12]。目前，很多适配体序列已被成功分离，相应的靶标包含小分子[13]、蛋白质[14]、细胞系[15]、病毒[16]等。有多种方法被用于筛选蛋白靶标，如亲和色谱柱法 [17]、磁珠法[18]、硝酸纤维素膜法[19]等。由于适配体具有高灵敏度、高特异性的特点，基于适配体的传感器近年也得到了迅猛发展[20，21]。目前，已发展出可用于小分子检测[13，22]、蛋白分子检测[23]、细胞成像[15，24] 等的适配体传感器。

本研究以外源性凝血途径的核心因子FVIIa为靶蛋白，基于硝酸纤维素膜分离的筛选方法，成功分离出FVIIa的DNA适配体，此适配体与FVIIa蛋白结合的表观解离常数为102 nmol/L，并具有较好的选择性。基于所获得的高亲和力适配体，建立了一种简单的荧光传感方法，用于检测FVIIa蛋白。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Eppendorf Mastercycler Nexus PCR仪（德国Eppendorf公司）; VICTOR×4酶标仪（美国PerkinElmer公司）; 电泳仪（美国BioRad公司）; LAS 4000 mini凝胶成像系统（日本Fujifilm公司）。

人凝血因子 7a蛋白由诺和诺德中国研发中心周蓉博士提供;  DNA序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）; 0.45-μm硝酸纤维素膜（通用电气医疗系统贸易发展（上海）有限公司）; 25-mm 可拆卸滤器（默克密理博实验室设备（上海）有限公司）; 链霉亲和素琼脂糖微珠、SYBR Green Ι（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）; 10×PCR缓冲液、脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、rTaq 聚合酶、20 bp DNA Marker、6×DNA上样缓冲液、PMD18-T载体克隆试剂盒（宝日医生物技术（北京）有限公司）; 工程化大肠杆菌 BL21 （美国模式培养物集存库）; 10×PBS缓冲液、5×TBE缓冲液、鲑鱼精DNA、LB液体培养基（干粉）、LB固体培养基（干粉）、30% 丙烯酰胺、10% 过硫酸铵、四甲基乙二胺（北京索莱宝科技有限公司）; 琼脂糖、NaOH、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、MgCl2、牛血清白蛋白、十二烷基硫酸钠、乙二胺四乙酸、Na2CO3、NaHCO3（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司）。所用试剂均为分析纯， 实验用水为超纯水。

2.2 实验方法

2.2.1 溶液配制 结合缓冲液为1×PBS， 5 mmol/L MgCl2， 0.1 mg/mL牛血清白蛋白， 25 μg/mL鲑鱼精DNA。储备溶液为2×结合缓冲液。各溶液配制后于20℃保存。

洗脱缓冲液含7 mol/L 尿素、7 mmol/L 十二烷基硫酸钠和1 mmol/L 乙二胺四乙酸。储备溶液为1×洗脱缓冲液。配制后于4℃保存。

纯化液为鲑鱼精DNA、乙酸钠和无水乙醇的混合液： 准确称取20 mg 鲑鱼精DNA、12.30 g NaAC溶于50 mL水中，并用乙酸调节至pH 5.2，以无水乙醇定容至500 mL，混匀，于20℃保存。

包被液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH=9.6），封闭液为3%（w/V））牛血清白蛋白溶液。

2.2.2 筛选过程 （1）负筛选过程 取100 μmol/L 随机寡核苷酸库20 μL 溶于50 μL水中，95℃水浴加热5 min，取出冷却至室温，加入50 μL 2×结合缓冲液，轻微振荡摇匀。室温下与纯净的硝酸纤维素膜共孵育1 h，弃膜，收集上清液，用于后续正筛选。（2）正筛选过程 将上述处理过的随机寡核苷酸库与200 μL人凝血因子7a 蛋白溶液于室温下共孵育1 h。将硝酸纤维素膜固定在可拆卸滤器中，使用1×结合缓冲液润湿滤器中的硝酸纤维素膜，使共孵育液缓慢的通过硝酸纤维素膜，此过程重复5次。使用800 μL 1×结合缓冲液缓慢洗去游离在膜表面的寡核苷酸序列，此过程重复3次。（3）变性 将硝酸纤维素膜取出并将其剪碎，转移至1.5 mL 离心管中。加入200 μL 洗脱缓冲液，充分振荡。95℃水浴加热10 min，使蛋白变性，与寡核苷酸分离。此过程重复2次，合并两次洗脱液。（4）纯化 加入1 mL纯化液，80℃ 静置2 h。4℃ 下14000 r/min 离心25 min。弃上清液，加入1 mL 70%（V/V）预冷乙醇，重复离心1次，弃上清液，65℃ 烘箱中烘干。（5）扩增 将干燥的寡核苷酸粉末用150 μL水溶解。每个PCR反应体系为50 μL，每个反应体系含有400 μmol/L dNTPs、1 μmol/L 正向引物、1 μmol/L 反向引物、25 U/mL rTaq聚合酶、5 μL 10×PCR缓冲液、2 μL DNA模板，总反应体系6 mL; 将PCR程序设置为： 95℃ 5 min; 94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s（将此步设为10～20个循环）; 72℃ 5 min; 10℃ 保持至结束。将PCR产物进行凝胶电泳以检验产物纯度，取 8 μL PCR 产物与 2 μL 6×DNA电泳缓冲液（每 mL 含有 SYBR GReen I 10 μL）混匀后上样，凝胶为3%非变性琼脂糖凝胶，电泳缓冲溶液为1×TBE缓冲液，电压为140 V。电泳结束后利用凝胶成像系统对其拍照并分析。（6）制备单链 將PCR产物与链霉亲和素修饰的琼脂糖亲和柱孵育，由于PCR使用生物素标记的反向引物，利用生物素和亲和素的相互作用将PCR产物固定在亲和柱上。用800 μL 1×结合缓冲液洗3次后，用0.1 mol/L NaOH溶液洗脱ssDNA，并用适量HCl中和NaOH。加入1 mL 预冷无水乙醇，80℃静置2 h。4℃下14000 r/min 离心25 min。弃上清液，加入1 mL 70%（V/V）预冷乙醇; 重复离心1次，弃上清液，65℃烘干。将干燥的寡核苷酸粉末用20 μL水溶解，取1 μL稀释至50 μL，测定260 nm处的吸光度，计算其中寡核苷酸含量。重复步骤（1）～（6）。自第二轮筛选开始寡核苷酸随机文库的用量降至300 pmol。

2.2.3 测序与序列分析 扩增经过数次筛选的富集库，转入工程化大肠杆菌BL21中， 37℃ 培养过夜; 挑取随机菌落并送至苏州金唯智生物科技有限公司测序。

利用序列比对程序对所得序列进行分析，如 ClustalX 1.83 比对序列，分析适配体序列的一级结构及其同源性，将各序列分组，并用 NUPACK 模拟其二级结构，选择结构具有代表性的序列进行合成，以进行后续分析。

2.2.4 荧光测量 将96 孔ELISA酶标板用200 μL 1×结合缓冲液预先润洗1次，孔中包被100 pmol靶蛋白溶液（1 μmol/L， 100 μL，使用包被液稀释），或等量对照蛋白（牛血清白蛋白和链霉亲和素），4℃ 下湿盒中过夜，弃去蛋白溶液。在包被蛋白的孔中加入封闭液，37℃孵育2 h; 将50 μL FITC修饰的随机文库或适配体序列在95℃水浴中加热5 min，取出冷却至室温，加入50 μL 2×结合缓冲液，混匀后加入处理过的酶标板中，37℃下孵育2 h; 用1×PBS洗去游离的DNA，使用酶标仪读取（底读）实验孔在485 nm处荧光强度。

2.2.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 将100 pmol 靶蛋白（20 μmol/L， 5 μL） 与 200 pmol （200 μmol/L， 1 μL） 已预先退火的荧光标记的适配体链混匀，加入4 μL 2×结合缓冲液，室温下孵育1 h， 同时设置空白对照及牛血清白蛋白和链霉亲和素作为阴性对照。孵育后加入2 μL 6×DNA上样缓冲液，混匀后上样。凝胶为8% 非变性聚丙烯酰胺凝胶，电泳电压80 V。电泳结束后利用凝胶成像系统对其拍照并分析。

2.2.6 统计学分析 采用Origin Pro 8.5 软件进行统计学分析，两组间差异分析采用t检验， 组间多样本均数比较采用单因素方差分析。

3 结果与讨论

3.1 筛选方法

本研究选择硝酸纤维素膜分离方法用于筛选靶蛋白FVIIa的DNA核酸适配体。在筛选过程中，先使蛋白与核酸文库在缓冲溶液中孵育，再依靠膜对蛋白的吸附作用分离有作用的DNA序列。这种先孵育再分离的方法使得蛋白与适配体的结合在液相均相中进行。

硝酸纤维素膜对蛋白的吸附作用使得适配体-蛋白复合物保留在膜表面，再用缓冲液洗去游离在膜表面的未结合的序列，留存在膜上的DNA经过提取纯化后，进行PCR扩增，进入到下一轮筛选中。

采用荧光法监测筛选过程中库的富集效果。FITC标记的核酸库由FITC标记的正向引物通过PCR反应制得。如图1所示，随着筛选轮数的增加，保留在蛋白表面的序列增多，荧光强度增强。经过11轮富集，荧光强度不再发生明显增长，因此对第11轮文库进行测序。

3.2 测序结果

经第11轮筛选的文库被转入工程化大肠杆菌BL21中，培养过夜后，挑取随机单克隆菌落进行测序。对测序结果进行同源性分析，结果如图2所示。将所获得序列通过M-fold （http：//unafold.rna.albany.edu/） 做二级结构模拟，合成有一定同源性且二级结构相对稳定的序列，并做进一步分析。如图3所示， 选择FVIIa-7和FVIIa-16， 并在5'端标记FITC， 以进一步考察亲和力和特异性等，FVIIa-7和FVIIa-16的二级结构如图3所示。相关寡核苷酸序列见表1。

3.3 亲和力测定

通过荧光法测定适配体的亲和力（解离常数）。先将靶蛋白固定在酶标板上，再使之与荧光标记的适配体作用。除去游离在表面的适配体，可检测的荧光信号全部来自与蛋白作用的适配体，荧光信号越强，说明与蛋白作用的适配体越多。本方法操作简单，所需试剂种类及数量较少，是一种简单经济的表征方法。如图4所示，配制终浓度为0、10、25、50、75、100、125、150、200、300、400和500 nmol/L的适配体（每孔100 μL）与靶蛋白作用，按公式（1）拟合，解离常数（Kd）計算结果由Graphpad Prism 5给出：

其中， F为加入适配体后的荧光信号，F0为背景信号， c为所加入适配体的浓度， Fmax为拟合曲线Y轴上最高点， Kd为所求的解离常数。

FVIIa-7的解离常数为296.3 nmol/L（图4A），而FVIIa-16具有更高的亲和力，解离常数为102.0 nmol/L（图4B）。

3.4 FVIIa的定量检测

采用竞争结合法确定FVIIa-16对靶蛋白的检测浓度范围。

实验原理如图5所示，在溶液相中加入不同量的蛋白，与适量的适配体孵育，再将含有蛋白-适配体复合物、游离蛋白、游离适配体的混合溶液加入到包被了FVIIa蛋白的酶标板中，通过测定与酶标板上固定蛋白结合的适配体发出的荧光信号，间接反映待测溶液中FVIIa蛋白的浓度。

首先在酶标板中包被100 pmol靶蛋白，将终浓度为0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、200和300 nmol/L 的靶蛋白与200 pmol已变性处理的适配体在结合缓冲液中 （总体积100 μL）于 37℃孵育1 h，将溶液依次转移至包被有蛋白的酶标板中，37℃下孵育2 h; 洗去游离的DNA，测定各孔在485 nm 的荧光强度。如图6所示，适配体对FVIIa-16定量检测范围为30～80 nmol/L，线性回归方程为 ΔF485 nm=-6.18C （nmol/L） + 602.27（R2=0.978）。

3.5 方法的特异性

通过聚丙烯酰胺凝胶电泳考察适配体的特异性 [18]，如图7所示，荧光标记的适配体与FVIIa结合后，相比于对照组蛋白条带滞后。利用荧光法检验了荧光标记的适配体与FVIIa及对照组蛋白间的作用，酶标板中每孔包被100 pmol蛋白，与300 pmol 已变性处理的适配体孵育，记录其荧光强度; 基于t检验计算同种蛋白组间显著性差异，结果如图8所示，空白对照组为不加适配体的蛋白本底荧光值，样品组为加入荧光标记适配体的响应值，结果表明，FVIIa-16能显著区分靶蛋白的空白对照与样品组，而不与其它对照蛋白作用，具有良好的特异性。

4 结 论

采用硝酸纤维素膜法，经过11轮筛选，成功筛选分离了人凝血因子FVIIa的DNA适配体。此适配体的表观解离常数为102.0 nmol/L，对FVIIa定量检测范围为30～80 nmol/L，具有良好的选择性。FVIIa蛋白的RNA适配体已被成功分离，此适配体可通过阻止TF-FVIIa复合物的形成影响FVIIa，并延长凝血时间[25]。但RNA成本高，并需要严格的使用环境。DNA适配体成本较RNA适配体低，合成简单，并具有更好的稳定性。本研究筛选的DNA适配体与FVIIa有较高的亲和性，可用于FVIIa的高灵敏、高选择性的检测，并有望基于此适配体开发经济有效的凝血剂或抗凝剂。

References

1 Davie E W， Fujikawa K， Kisiel W. Biochemistry， 1991， 30（43）： 10363-10370

2 Srensen B B， Persson E， Freskgrd P O， Kjalke M， Ezban M， Williams T， Rao L V M. J. Biol. Chem.，  1997，  272（18）： 11863-11868

3 McCallum C D， Hapak R C， Neuenschwanderi P F， Morrisseyi J H， Johnson A E. J. Biol. Chem.，  1996，  271（45）： 28168-28175

4 Nemerson Y. Blood，  1988，  71（1）： 1-8

5 Lawson J H， Butenas S， Mann K G. J. Biol. Chem.，  1992，  267： 4834-4843

6 Banner D W， D'Arcy A， Chène C， Winkler F K， Guha A， Konigsberg W H， Nemerson Y， Kirchhofer D. Nature，  1996，  380（6569）： 41-46

7 Hoffman M， Monroe D M， Oliver J A， Roberts H R. Blood，  1995，  86（5）： 1794-1801

8 Tuerk C， Gold L. Science，  1990，  249（4968）： 505-510

9 Ellington A D， Szostak J W. Nature，  1990，  346（6287）： 818-822

10 WANG Wei-Wei， LIU Su-Qin， XUE Yun， WANG Yan， YAN Chao. Chinese Journal of Chromatography， 2017， 35（1）： 99-104

王薇薇， 刘素琴， 薛 芸， 王 彦， 阎 超. 色谱， 2017， 35（1）： 99-104

11 LIU Xiao-Hui， WANG Ze-Cheng， ZHANG Xiao-Bing， XU Dan-Ke. Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（12）： 1971-1979

刘晓辉， 王则呈， 张晓兵， 许丹科. 分析化学， 2017， 45（12）： 1971-1979

12 Liu J， Cao Z， Lu Y. Chem.  Rev.，  2009，  109（5）： 1948-1998

13 Luo Y， Wang J， Yang L Y， Gao T， Pei R J. Sens. Actuators B，  2018，  276： 128-135

14 DU Zhen-Ya， JIA Ru-Han， LI Wen-Hui， YANG Jing， XI Jing， SHI Da-Lin， HAN Yue-Wu. Chin. J. Biochem. Mol. Biol.，  2018，  34（10）： 1065-1072

杜振亚， 贾茹涵， 李文慧， 杨 静， 习 静， 石大林， 韩跃武. 生物化学与分子生物学报，  2018，  34（10）： 1065-1072

15 Wang J， Zhang Y J， Chen Y， Hong S N， Sun Y， Sun N， Pei R J. Talanta，  2017，  175： 235-242

16 Liu D L， Zhang Z L， Yin Y J， Jia F， Wu Q P， Tian P， Wang D P. Talanta，  2019，  193： 199-205

17 LI Hui， WANG Wei， DING Hong-Mei， DONG Jie， HUANG Ai-Xue， LUO Zhao-Feng， LI Jie， BAI Chen-Jun， LI Shao-Hua， SHAO Ning-Sheng. Lett. Biotech.，  2018，  29（4）： 459-464

李 慧， 王 玮， 丁红梅， 董 洁， 黄皑雪， 罗昭锋， 李 洁， 白琛俊， 李少华， 邵宁生. 生物技术通讯，   2018，  29（4）： 459-464

18 Abdessamad T A， Laura F， Nick M， Jamal I， Pascale R， William J. Nucleic Acids Res.，  2002，  30： 10e35

19 LIU Zhong-Cheng， ZHAO Li-Jun， ZHANG Yan-Fen， SHI Hai-Lang， XIE Yao. Acta Pharm. Sin.，  2012，  47（12）： 1605-1611

劉中成， 赵丽君， 张艳芬， 时海浪， 解 瑶.  药学学报，   2012，  47（12）： 1605-1611

20 WANG Kun， TAO Zhan-Hui， XU Lei， LIU Ya-Qing. Chinese J. Anal. Chem.，  2014，  42（2）： 298-304

王 昆， 陶占辉， 徐 蕾， 刘亚青. 分析化学，  2014，  42（2）： 298-304

21 DU Yu-Lin， MO Liu-Ting， YI Ya-Sha， QIU Li-Ping， TAN Wei-Hong. Chinese J. Anal. Chem.，  2017，  45（12）： 1757-1765

堵玉林， 莫柳婷， 易娅莎， 邱丽萍， 谭蔚泓.  分析化学，   2017，  45（12）： 1757-1765

22 Stojanovic M N， de Prada P， Landry D W. J. Am. Chem. Soc.，  2001，  123（21）： 4928-4931

23 Nutiu R， Li Y. J. Am. Chem. Soc.，  2003，  125（16）： 4771-4778

24 Song W J， Strack R L， Sevensen N， Jaffrey S R. J. Am. Chem. Soc.，  2014，  136（4）： 1198-1201

25 Rusconi C P， Yeh A， Lyerly H K， Lawson J H， Sullenger B A. Thromb. Haemost.，  2000，  84： 841-848