基于阳离子共轭聚合物荧光共振能量转移结合杂交链式反应信号扩增检测端粒酶活性

周晓毓 赵建伟 马贵敏 贾红霞

摘 要 检测端粒酶活性对肿瘤、癌症的早期诊断，以及开发以端粒酶为靶标分子的抗肿瘤、抗癌药物具有重要意义。本研究基于阳离子共轭聚合物Poly[（9，9-bis（6'-N，N，N-trimethylammonium）hexyl）fluorenylene phenylene （PFP）与荧光染料SYBR Green I （SG）之间的荧光共振能量转移，建立了一种简单快速的端粒酶活性检测方法。当端粒酶存在时，引物探针被延伸，生成具有-（GGTTAG）n重复序列的DNA。然后通过链霉亲合素与生物素的特异性作用将端粒酶延伸产物连接在磁性微球上。加入与端粒酶延伸产物匹配的探针-（CTAACC）2。端粒酶延伸产物形成双链结构之后加入SG，SG能够特异性的嵌入到DNA双链结构中。最后，加入PFP。PFP是一种带有正电荷的水溶性共轭阳离子聚合物，可以通过静电作用与双链DNA发生吸附。PFP与嵌入在双链结构中的SG发生荧光共振能量转移（FRET）。根据FRET的效率可以实现对端粒酶活性的定量检测。本方法可以检测到3.0×105个Hela细胞中提取的端粒酶活性。将本方法与杂交链式反应（HCR）反应结合，可实现检测信号的放大，提高检测的灵敏度，可以检测到6.0×104个Hela细胞中的端粒酶活性，灵敏度提高了一个数量级。本方法简单、快速，无需标记、扩增过程，无酶参与，检测成本低，灵敏度高。

关键词 端粒酶; 活性; 阳离子共轭聚合物; 荧光共振能量转移; 杂交链式反应; 无酶信号放大

1 引 言

在正常细胞中，端粒随着细胞的有丝分裂而逐渐缩短，直至细胞凋亡[1，2]。端粒酶是一种具有反转录活性的核糖蛋白酶。它能够以自身具有的RNA序列为模板，对端粒DNA进行不断复制，阻止其缩短，使细胞无限增殖，不再凋亡。端粒酶在正常细胞中（除永生细胞）活性很低，很难被检测到; 它一般在肿瘤或癌细胞中被激活[3，4]。有研究表明，在肿瘤细胞中端粒酶的活性表达高达85%，肿瘤或癌细胞的强大活性与端粒酶被激活密切相关。通过检测端粒酶活性可以实现肿瘤或癌症的早期诊断。同时，建立灵敏的端粒酶检测方法对开发以端粒酶为靶标分子的抗癌药物具有重要意义[5，6]。

1994年，Kim等[7]提出了基于聚合酶链式反应（PCR）的端粒酶重复序列扩增法（Telomerase repeat amplification protocal，TRAP）用于端粒酶活性的检测。之后，各种基于TRAP的端粒酶活性检测方法相继被提出[8～11]。基于TRAP的端粒酶活性检测方法，灵敏度较高，可以检测到几个癌细胞中的端粒酶活性（以癌细胞数量为活性单位）; 但是，PCR过程操作步骤复杂，需要多个变温循环过程，耗时长; 扩增过程有聚合酶的参与，容易出现非特异性扩增。而且，端粒酶抑制剂可能会抑制PCR反应中聚合酶的活性，造成假信号的出现，不利于端粒酶抑制剂的筛选。

等溫扩增是近年出现的一类恒定温度下快速高效的核酸扩增技术。与PCR扩增相比，等温扩增无需不断变换反应温度，耗时短，扩增效率高，已被用于端粒酶活性的检测。2010年，Ding等[12]建立了基于等温循环链顶替扩增反应检测端粒酶活性的方法，可以检测到40个Hela细胞中的端粒酶活性。2012年，Tian等[13]建立的基于等温指数扩增反应（IEXPAR）检测端粒酶的方法可以检测低至1个癌细胞中的端粒酶活性。2016年，Wang等[14]建立的基于环介导等温扩增（LAMP）检测端粒酶活性的方法，实现了无背景信号的扩增，可以检测到1个癌细胞中端粒酶的活性。这些基于等温扩增技术检测端粒酶活性的方法的灵敏度与TRAP法相当。但是，这些扩增技术都需要聚合酶的参与，容易出现假阳性或假阴性信号，而且大多设计复杂，检测成本较高。

杂交链式反应（HCR）是一种无需酶参与，利用碱基互补配对进行交替杂交的信号放大技术。无酶参与能够避免由聚合酶导致的假信号的出现，提高方法的检测准确性。2015年，Wang等[15]基于HCR建立了一种电化学检测端粒酶活性的方法。该方法可以检测到2个Hela细胞中的端粒酶活性。但该方法需要复杂的电极修饰过程，而且需要对金纳米粒子进行标记，耗时长，过程繁杂。2016年，Hong等[16]基于HCR，利用荧光成像进行端粒酶活性分析。该方法可以检测到1个Hela细胞中的端粒酶活性，灵敏度高。该方法同样需要对金纳米粒子进行标记，而且需要结合金纳米粒子与氧化石墨烯共同作用，设计复杂。张佳玉等[17]基于HCR和磁分离技术建立了一种非常简单的荧光检测端粒酶活性的方法。该方法将端粒酶延伸产物特异性的DNA探针作为HCR引发探针，利用荧光直接检测信号放大结果，可以检测到1×105个Hela细胞中的端粒酶活性。该方法的主要缺点是灵敏度较低; 而且，DNA探针需要荧光标记，增加了检测成本。

共轭聚合物是一类含有高度离域的π电子共轭结构的高分子聚合物。水溶性共轭聚合物具有独特的光电特性和电解质的静电特性[18，19]。阳离子共轭聚合物已被广泛用于生物传感器的开发[20～23]。荧光共振能量转移（FRET）是一种独特的荧光现象，已成为一种备受关注的新荧光检测技术[24，25]。2017年，Chen等[26]建立的基于共轭聚合物与荧光素之间的FRET检测端粒酶活性的方法可达到5个细胞/mL的检出限，方法简单，灵敏度高，但同样需要用荧光素进行标记，检测成本较高。

Poly[（9，9-bis（6'-N，N，N-trimethylammonium） hexyl）fluorenylene phenylene （PFP）是一种能够发射荧光的水溶性共轭阳离子聚合物，由于其带有正电荷，可与带负电的生物大分子发生静电吸附[27]。本研究利用阳离子共轭聚合物-PFP与荧光染料-SG之间的荧光共振能量转移，结合HCR信号放大技术，建立了一种无需荧光标记、无酶参与的端粒酶活性分析新方法。无酶参与可有效避免聚合酶导致的假信号出现，提高方法检测的准确性; 结合HCR，有效提高了端粒酶活性检测的灵敏度。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Fluorolog 3-211荧光光谱仪（法国Horiba Jobin-Yivon公司）; 2720 热循环仪（美国Applied Biosystems公司）; KYC 100C摇床（上海福玛实验设备有限公司）。

3-[（3-胆胺丙基）-二甲基胺]丙烷磺酸（CHAPS）细胞裂解液（美国Millipore公司）。链霉亲和素（Streptavidin）表面功能化的磁性微球（直径 2.8 μm，10 mg/mL， 美国Dynal Biotech公司）。 20× SYBR Green I （SG） （DMSO溶剂，厦门致善生物技术公司）。PFP由中国科学院化学所王树课题组提供。实验用水均为二次去离子水。实验中所用DNA（聚丙烯酰胺电泳纯化）购于上海生物工程公司，序列见表1。

实验中所用缓冲溶液包括：1×PBS缓冲溶液（37 mmol/L NaCl， 10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4， 2.7 mmol/L KCl， pH 7.4）; 1×Tris-HCl缓冲溶液（10 mmol/L Tris-HCl， 1.0 mmol/L EDTA， 2.0 mol/L NaCl， 0.05% Tween-20， pH 7.3）; 端粒酶延伸反应缓冲溶液（20 mmol/L Tris-HCl， 1.5 mmol/L MgCl2， 70 mmol/L KCl， 1.0 mmol/L乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸 （EGTA）， 0.05% Tween-20， pH 8.3）。

2.2 实验方法

2.2.1 端粒酶的提取 培养的Hela细胞计数后用冷的1×PBS洗涤3次，在4℃以2000 r/min离心10 min。分离出的细胞加入冷的 1× CHAPS细胞裂解缓冲液，在冰上放置30 min，期间多次振荡，以保证细胞充分裂解。然后在4℃以12000 r/min离心30 min。取出含有端粒酶的上层溶液，于80℃保存，备用。

2.2.2 端粒酶的延伸 取适量端粒酶提取液、10 μmol/L标记生物素的端粒酶延伸引物（biotin-TS）、200 μmol/L dNTPs，在端粒酶延伸反应缓冲溶液中混合均匀，终体积为50 μL。置于热循环仪中，37℃下进行端粒酶延伸反应1 h; 90℃保持10 min，使端粒酶变性失活，终止反应。

2.2.3 FRET反应及荧光检测 取5 μL磁球，用1×Tris-HCl缓冲溶液洗涤3次，用1×PBS缓冲溶液悬浮，加入50 μL端粒酶延伸产物和250 nmol/L DNA probe，在热循环仪中70℃高温变性10 min，45℃复性杂交20 min。取出后，不断振荡，降至室温后进行杂交。磁分离，弃去上清液。磁球悬浮在1×PBS缓冲溶液中，加入0.6×SG荧光染料和100 nmol/L PFP，总反应体积100 μL。检测荧光强度，激发波长为380 nm，扫描范圍为400 ～650 nm，激发狭缝和发射狭缝均为4.5 nm。

2.2.4 基于HCR的FRET反应及荧光检测 取5 μL磁球，用1×Tris-HCl缓冲溶液洗涤3次。将磁球悬浮在1×PBS缓冲溶液中，加入适量端粒酶延伸产物和终浓度为250 nmol/L的DNA probe Ⅰ，总反应体积100 μL。在热循环仪中70℃高温变性10 min，45℃复性杂交20 min，自然冷却至室温。磁分离，弃去上清液，分别加入500 nmol/L的DNA probe Ⅱ和DNA probe Ⅲ，悬浮在100 μL 1×PBS缓冲溶液中。在30℃以200 r/min孵育2 h，进行HCR反应。

将HCR反应产物进行磁分离，弃去上清液，加入0.6×SG 荧光染料和125 nmol/L PFP，重新悬浮在100 μL 1×PBS中，检测荧光信号。激发波长为380 nm，扫描范围为400～650 nm，激发狭缝和发射狭缝均为4.5 nm。

3 结果与讨论

3.1 基于FRET检测端粒酶活性的原理

基于阳离子共轭聚合物PFP与SG之间的FRET检测端粒酶活性的原理如图1所示。生物素标记的端粒酶引物（Biotin-TS）在端粒酶和dNTPs作用下发生延伸反应，产生一条具有（GGTTAG）n重复序列的端粒酶延伸产物DNA。加入链霉亲和素表面功能化的磁性微球（Steptavidin magnetic bead），通过Steptavidin-biotin的特异性结合，将端粒酶延伸产物连接到磁球上。而细胞提取物及延伸反应中的其它反应物通过磁分离去除。加入与端粒酶延伸产物重复序列匹配的DNA探针（DNA probe：（CTAACC）2）。DNA probe与端粒酶延伸产物结合，形成双链结构。加入可与双链DNA特异性结合的荧光染料SYBR Green I （SG），SG嵌入到双链DNA的小螺旋结构中，加入带有大量正电荷的阳离子共轭聚合物PFP，通过静电作用与双链DNA结合，形成PFP-dsDNA-SG三聚体结构。PFP与SG之间的距离被拉近，发生荧光共振能量转移（FRET）。PFP的激发波长为380 nm，发射波长为425 nm。SG的激发波长为480 nm，发射波长为523 nm。通过检测SG和PFP荧光发射峰强度的比值（I523 nm/I425 nm）变化，从而检测端粒酶活性。定义I523 nm/I425 nm为荧光共振能量转移效率（FRET efficiency），端粒酶延伸产物越多，I523 nm/I425 nm越大，即PFP与SG之间FRET效率越高。

考察了本方法检测端粒酶活性的可行性。首先考察合成的端粒酶延伸产物（biotin-STEP）的FRET反应。空白溶液中不含合成的biotin-STEP，加入DNA probe不能形成双链结构，加入荧光染料SG无法发生PFP与SG之间的FRET。从图2可见，空白溶液在425 nm处荧光峰（PFP荧光峰位置）强度很大，而523 nm处荧光峰（SG荧光峰位置）非常弱; 样品在425 nm处荧光峰强度明显降低，523 nm处荧光峰强度显著增加。证明端粒酶延伸产物可以引起PFP与SG之间有效的FRET。