吸毒人群人类免疫缺陷病毒1型血清亚型的测定

陈荣华，李勤光，赵敏，康惠玲，陈惠聪

福建医科大学孟超肝胆医院肝病研究所 （福建福州 350025）

人类免疫缺陷病毒（humanimmunodef iciencyvir us，HIV）具有高度变异性和重组性，依据血清学反应和病毒核酸序列测定将其分为HIV-1和HIV-2两大类型［1］。按照HIV-1的gag基因与env基因变异程度又可以分为A～J和O亚型。各基因亚型间存在较大的基因序列差异，在不同区域和不同感染对象中各亚型的分布也有所不同。HIV-1感染以吸毒人群为主，为了进一步了解吸毒人群HIV-1毒株血清亚型的分布情况，为制定防控方案、疫苗和诊断试剂研制提供更科学的依据，现以我市HIV-1感染吸毒人员20例为研究对象，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016-2018年我市HIV感染吸毒人员20例，经免疫印迹（WB）试验确认为HIV-1阳性，采用一对一问卷调查方式记录并整理研究对象的一般情况与HIV感染行为情况。20例HIV-1感染吸毒人员一般资料见表1。

表1 20例HIV-1感染吸毒人员的一般资料

1.2 方法

1.2.1 血样采集方式EDTA-K2抗凝采血管采集抗凝血4～5 ml，将采集血样颠倒混匀后进行分装，并于-80℃冰箱中保存，所有血样经过HIV检测并经WB试验方法进行确认。

1.2.2 Nested-PCR检测方法

应用套式PCR对HIV前病毒gag基因进行扩增，扩增片段长度为1 081 bp，试剂为TaKaLa PrimeSciptTMOne Step RTPCR Ver．2和Prime Ex TaqTMHot Start Version扩增引物：（MK603）CAG-AAA-AAT-TGT-GGG-TCA-CAGTCT-ATT-ATG-GGG-TAC-CT（在V3区的位置：5914-5931），（CO602）GCC-CAT-AGT-GCT-TCC-TGCTGC-TCC-CAA-GAA-CC（在V3区的位置：7410-7329），（EB2）GCC-GGA-TCC-TCA-ACT-CAA-CTG-CTG-TTA-AAT（在V3区的位置：6989-7009），（EC2）GCT-CTG-CAG-TCA-AAT-TTC-TGG-GTCCCC-TCC-TGA-GG（在V3区的位置：7314-7336）。

第1轮扩增反应条件为预变性95℃1′，变性9 5℃1′，退火55℃1′，延伸72℃2′，循环数35，浸泡72℃7′。第2轮扩增反应条件为预变性95℃1′，变性95℃1′，退火55℃1′，延伸72℃1．30′，循环数35，浸泡72℃7′。

扩增产物置于2%琼脂糖凝胶上电泳20 min，电压100 V，采用溴化乙锭染色，于紫外光下观察。

1.2.3 多肽免疫酶法（PEIA）检测方法

包被抗原为HIV-1亚型合成多肽抗原，即E、B′、B（mn）、C、D，包被抗原100μl／孔，4℃下放置18 h，以200μl牛奶缓冲液于37℃下封闭90 min，经3次洗涤。每孔加入血清标本于37℃下放置1 h，经3次洗涤后每孔加入酶结合物100μl于37℃下放置1 h，经3次洗染后每孔加底物100μl避光显色5 min。每孔加2M H2SO450μl终止。于492 nm波长下检测OD值（阳性：OD值＞0．3；阴性：OD值≤0．3）。

1.2.4 sanger测序方法

不确定的亚型送检上海博尚生物公司进行测序分析。使用美国ABI公司荧光标记末端终止循环测序试剂盒测定gag基因序列，用ABI公司的Sequencing nallysing 5．0软件进行分析和编辑序列数据，通过美国拉莫斯国家实验室HIV核酸序列库的HIV-BLAST工具与国际参考毒株序列进行比较，据同源性确定HIV-1亚型。

2 结果

2.1 Nested-PCR检测情况

20例HIV-1感染吸毒人员共检测20份HIV-1血清抗体阳性标本，其中18份检出V3区基因产物。

2.2 PEIA检测情况

HIV-1血清亚型：20例HIV-1感染吸毒人员共检测20份HIV-1血清抗体阳性标本，其中17份血清亚型阳性，C亚型9份，E亚型1份，C和E亚型均反应7份，未发现B＇、B（mn）、D亚型。

2.3 sanger测序方法检测情况

HIV-1血清亚型：3份无法确认分型的采用sanger测序方法可以准确分型，C亚型2份，E亚型1份。

3 讨论

3.1 HIV-1血清亚型测定的意义

我国首次HIV分子流行病学调查提示绝大部分血液传播途径的感染者属于B亚型毒株，并且这一亚型在我国流行区域十分广泛［2］。第2次全国HIV分子流行病学研究发现CRF01-AE亚型仍然以性传播人群为主，但吸毒人群感染CRF01-AE亚型的人数比例明显增大。吸毒人群具有静脉注射、共用针头、高危性行为等特点。静脉共用注射器吸毒、无保护性交是导致吸毒人群感染HIV-1的主要因素［3］。HIV-1病毒反转录酶缺乏校正功能易发生复制错误，复制过程中易产生大量点突变或点插入、点缺失，进而引发重组，形成大量亚型内重组毒株或亚型间重组毒株。HIV-1型分为M、O、N 3组，M组分为A、B、C、D、F、G、H、J、K 9个基因亚型和16个流行重组形式［4］。现阶段伴随HIV-1持续快速变异与世界人流流动的日趋频繁，未来将会出现更多的组、亚型、混合感染、超感染等，这些都对HIV-1的监测和防控带来更大的困扰。因不同HIV基因亚型与流行重组形式和传播能力存在显著相关性，不仅会导致不同疾病进程，而且对抗病毒方案的效果产生一定影响。

不同亚型HIV感染进展为获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的速率不同，调节HIV转录的反式激活蛋白的高水平表达可促使HIV快速繁殖［5］。O组病毒对非核酸逆转录酶抑制剂具有天然抗性，M组亚型对目前使用药物具有相似敏感性，F亚型对非核酸逆转录酶抑制剂的敏感性较低，G亚型对蛋白酶抑制剂敏感性较低［6］。因病毒选择性积累抗药性变异会对药物疗效产生影响，故对HIV-1病毒亚型基因编码区进行定期抗性突变检测，能够为药物选择提供一定参考。对于疫苗研发工作，基因变异是目前发展AIDS有效疫苗的主要制约因素，现阶段绝大多数候选疫苗是基于B亚型的包膜蛋白设计的。HIV亚型之间存在交叉保护作用，其包膜蛋白的氨基酸序列存在一定的差异，现有候选疫苗能否诱发抗体产生交叉中和尚无法确认［7］。了解流行HIV基因亚型，掌握流行重组形式的种类、分布与变化情况，对于研制具有地区特色的疫苗、减少疫苗株和流行株之间的差异有着重要意义。

3.2 HIV-1血清亚型的测定情况

我国是世界上HIV-1病毒亚型流行较多的国家，HIV-1筛查工作尤为艰巨。常见的HIV抗体测定方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）法、化学发光法、快速检测法，此外，抗体确证试验、免疫印迹试剂盒条带免疫试验、核酸定性和核酸定量试验等也常作为补充试验用于HIV检测。上述HIV抗体检测可用于临床诊断、血液筛查和监测等，以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，以血液筛查为目的的检测是为了防治输血传播HIV，以监测为目的的检测是为了了解不同人群HIV感染率与变化趋势。尽管我市AIDS疫情总体上属于低流行，但近年来AIDS发病率增长较快，有明显上升趋势。因吸毒人群是感染HIV-1的主要群体，故本研究选取近3年来20例确认感染HIV-1的吸毒人员作为研究对象，分析HIV-1血清亚型。本研究中HIV-1毒株血清亚型为C、E和CE混合型，其中C亚型为优势亚型。除上述亚型外，可能还存在其他未能检测出的亚型。同一研究对象可能同时感染不同亚型的病毒株或已出现重组毒株。故本研究20例吸毒人群HIV-1病毒血清亚型具有显著的多样性特点。本研究采用PEIA法测定HIV-1血清亚型，具有简便、快捷、经济性、实用性等优势。

3.3 HIV防治思路分析

HIV重组体毒株是多种毒株混合感染、多种毒株在机体复杂免疫环境中优势选择而产生的结果，往往较为单一基因亚型毒株却有着更强的传播能力［8］。本研究中，20例HIV-1感染吸毒人员中C亚型为优势亚型。由于本研究对象HIV-1病毒血清亚型具有多样性特点，将来可能出现重组型毒株，导致我市HIV流行情况更加复杂，为HIV／AIDS的防治带来更大的挑战。故结合本研究情况，在疫苗研发、诊断试剂研制、抗病毒方案制定等方面应考虑本地区的HIV-亚型种类、分布情况、变异趋势与显著特征，做好HIV-1毒株亚型与变异情况的监测，确保能够及时准确地发现HIV-1的流行趋势和发展趋势，有针对性地开展预防和控制。

本研究样本量较少，HIV-1毒株血清亚型和HIV-1流行株耐药情况分析，应进行连续性的动态监测，才能及时发现重组型毒株和耐药情况。因此，在今后HIV／AIDS防治工作中，需加强对HIV-1血清亚型和耐药的监测，加强对吸毒人群的监测和干预力度，从而遏制吸毒人群HIV传播蔓延的趋势。

综上所述，本组HIV感染吸毒人员HIV-1毒株存在多种亚型，其中以C亚型为优势亚型，近年来，该亚型在我国HIV-1感染者中增长迅速，并从吸毒人群逐渐向普通人群扩散。在我市HIV／AIDS防治中，应进一步加强对HIV-1毒株亚型及其变异的研究，充分掌握我市HIV-1亚型种类、特征、分布与变异趋势，及时准确发现HIV-1疫情，针对不同HIV-1毒株亚型采取不同措施进行防治。同时，加强对戒毒所、娱乐场所的监管，打击吸毒贩毒行为，对吸毒人员进行HIV筛查，加强区域检测实验室网络建设，扩大检测人数及范围，有效控制吸毒人群AIDS的蔓延与流行。