落叶松自然条件下感染松材线虫初报

于海英，吴昊，张旭东，王立明，张歆逢，宋玉双

(1.国家林业局森林病虫害防治总站，林业有害生物监测预警国家林业局重点实验室，辽宁 沈阳 110034；2.辽宁省林业有害生物防治检疫局，辽宁 沈阳 110084；3 新宾县林业局监测中心，辽宁 新宾 113200 )

落叶松属Larixspp.植物产于北半球高山及高寒地带，广泛分布于我国东北、华北、西北等地区[1]，是我国北方地区重要的用材和生态树种[2]。松材线虫Bursaphelenchus xylophilus在我国危害马尾松Pinus massoniana、油松P.tabulaeformis、赤松P.densiflora、华山松P.armandii、黑松P.thunbergii等多种松科松属树种[3-5]，是一种危险性极高的外来有害生物。近年来，松材线虫在向北扩散蔓延的过程中不断危害红松P.koraiensis等新寄主[6]，国外资料曾记载可危害落叶松[7]，但我国未曾发现自然条件下感染落叶松的案例。2018年秋季辽宁省抚顺市出现长白落叶松Larix olgensis、日本落叶松L.kaempferi和华北落叶松L.principis-rupprechtii大面积枯死现象，笔者对该地区落叶松异常枯死情况进行调查及病原线虫检测，明确了松材线虫在我国北方自然条件下能够自然感染落叶松，为东北地区松属以外的松科树种的松材线虫病预防和除治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样地概况及取样 2018年8月30日至9月6日，对辽宁省抚顺市2 个样地共78 株枯死树取样。

新宾县南杂木镇南杂木村6 林班52 小班，海拔216 m，面积0.7 hm2，树种为日本落叶松，林龄45 a，取24 株枯死树病样。

清原县红透山镇北杂木村32 林班15 小班，海拔150 m，面积2.8 hm2，日本落叶松、长白落叶松和华北落叶松比例为 5∶4∶1。平均林龄 42 a。取日本落叶松枯死树26 株、长白落叶松枯死树23 株、华北落叶松枯死树5 株，共54 株枯死树病样。

1.2 病树取样 离地1.2 m 处采集5 cm 厚的圆盘；用砍刀将树皮削掉，砍取木质部碎片，深度超过1 cm；用电钻(≥1 cm 直径麻花钻头)钻取木质部5 cm深木颗粒，装入标本袋。共采集样本78 份，用于分离鉴定病原线虫。

1.3 线虫分离 采用贝尔曼漏斗法进行线虫分离。将采集木样劈成火柴棍大小，2 层纸巾包好，纯净水浸泡24 h 后漏取2 mL 左右线虫悬浮液放入离心管中，3 000 r / min 离心5 min 后，吸取管底线虫液用于形态鉴定和分子鉴定。

1.4 形态鉴定 用100 μL 移液枪吸取离心管底部线虫悬浮液滴至载玻片，在体视解剖镜下用10 μL移液枪分别挑取线虫雌、雄成虫不少于1 头，将其置于酒精灯火焰上方加热3～5 s，线虫热杀死后加盖玻片，制成临时玻片，在显微镜下观察线虫形态特征并进行形态鉴定。未见线虫成虫虫态的用10 μL 移液枪挑取线虫幼虫100 头接种到灰葡萄孢菌Botrytis cinerea培养基上，25 ℃培养箱培养 5～10 d，待灰葡萄孢菌丝取食完毕，用蒸馏水将线虫洗出获得线虫成虫；部分木样充分吸水后于30 ℃恒温培养72 h[8]，重复1.3 步骤分离直接获得线虫成虫。

1.5 分子鉴定 用100 μL 的移液枪吸取1.3 分离后的离心管底部线虫悬浮液，放入载玻片凹片里，低倍显微镜观察是否有线虫，用移液枪在低倍显微镜(4 ×物镜)下吸取20 μL 线虫悬浮液(确保用于分子鉴定的液体中至少含一条线虫)置于200 μL PCR管中，按照松材线虫检测试剂盒(南京生兴生物技术有限公司提供)要求的步骤提取线虫DNA，进行实时荧光定量 PCR 扩增和检测[9]。20 μL 线虫悬浮液中加入线虫裂解液(A 液)20 μL，蛋白酶K 液(B 液)2 μL，置于金属浴中于 68 ℃ 条件下保温处理40 min，于95 ℃下保温处理10 min；12 000 r/min离心3 min，上清液(模板DNA)用于扩增 。PCR 扩增反应体系共10 μL，包括 TaqMan 通用 PCR 预混液 (TaqMan Universal PCR Master Mix) 5 μL，10 μmol/L TaqMan 探针0.5 μL，10 μmol/L 正向引物与反向引物各 0.5 μL，模板 DNA 3.5 μL。正向引物序列为 5′-GAGCAGAAACGCCGACTT-3′，反向引物序列为 5′-CGTAAAACAGATGGTGCCTA-3′，TaqMan探针序列为5′-TGCACGTTGTGACAGTCGT-3′，探针5′端标记发光基团为6-carboxyfluorescein(FAM)，3′端标记的淬灭基团为 tetramethyl-carboxy-rhodamine(TAMRA)。PCR 反应程序为松材线虫自动化快速检测仪(南京生兴生物技术有限公司生产)自动检测程序，即95 ℃运行10 min，进入循环程序:95 ℃下运行15 s，60 ℃下运行35 s，共35 个循环。

2 结果与分析

2.1 落叶松异常枯死情况 共调查枯死落叶松78株，经检视，均有小蠹虫危害，未发现天牛产卵刻槽及侵入孔，木质部未发现天牛及其他蛀干害虫蛀道。78 株枯死树中有11 株分离出松材线虫，28 株无线虫，其余木样含滑刃属、伞滑刃属等寄生线虫及部分腐生线虫，未发现拟松材线虫(表1)。松材线虫感染率为14%。

11 株含松材线虫的落叶松中有7 株日本落叶松、3 株长白落叶松、1 株华北落叶松。受松材线虫感染的落叶松半枯状态的中下部针叶退绿变黄，全枯状态落叶松为黄褐色，并伴随针叶脱落现象。

落叶松林中枯死树多分布于林缘地带，或与原感病红松林、油松林(已伐除)相接区域的落叶松枯死现象严重。

表1 枯死落叶松上病原线虫分离情况

2.2 线虫鉴定结果

2.2.1 形态观察结果 雌线虫热杀死后虫体略向腹面弯曲，虫体纤细，长约1 mm，头体交界处缩益明显；有口针，口针基部有小的膨大；中食道球卵圆形，占体宽的3/4 左右，瓣门清晰；阴门位于虫体中后部，阴门盖明显；部分雌虫尾部呈指状，末端钝圆，部分雌虫尾部有尾尖突。雄虫热杀死后虫体呈“J”形，虫体前部与雌虫相似；交合刺呈弓形，成对，基顶和喙突显著，喙突锐尖，内缘和外缘末端有盘状突；尾端尖细，侧观呈爪状，尾腹面观可见卵圆形交合伞。(图1)。经形态学鉴定，确定为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus。并对松材线虫形态进行测量(表2)。

图1 分离自辽宁抚顺地区落叶松松材线虫形态特征

表2 枯死落叶松上分离的松材线虫形态测量值

2.2.2 分子鉴定结果 从感病落叶松上分离疑似松材线虫，以其DNA 为模板进行PCR 扩增，荧光信号由本底开始进入指数增长阶段的循环次数，即Ct值在19～28 之间。经快速检测仪检测鉴定，结合落叶松的发病特征和线虫形态特征，确定落叶松中分离的部分病原线虫为松材线虫。

3 结论与讨论

通过形态观察和分子生物学鉴定明确了松材线虫在我国北方自然条件下能够自然感染落叶松。落叶松是我国东北、内蒙古林区以及华北、西南的高山针叶林主要组成树种，是东北地区主要三大针叶用材林树种之一。落叶松因其是针叶树种中最耐寒的树种，在东北地区广泛种植，占人工林总面积的70%[10-11]，且多为落叶松纯林，一旦大面积感染松材线虫，将会造成无法弥补的巨大损失。

取样的枯死落叶松中松材线虫检出率为14%，其余落叶松枯死原因有待进一步研究。落叶松枯死树多分布于林缘地带或与原感染松材线虫的红松林、油松林接壤处，因红松、油松已清理，可能因媒介昆虫云杉花墨天牛Monochamus saltuariusGebler 缺乏食物而取食落叶松，造成落叶松感染。此外，落叶松中分离的松材线虫与从油松、红松中分离的松材线虫形态对比，个体略小，线虫数量少，其原因还需深入研究。

目前，落叶松上除小蠹虫危害较重外，未发现落叶松木质部中的天牛蛀道和其他蛀干害虫蛀道。据记载，落叶松八齿小蠹Ips subelongatusMotschulsky、云杉大黑天牛Monochamus urussoviFisher、云杉小黑天牛Monochamus sutorLinnaeus、白带长角天牛Acanthocinus carinulatusGebler 等蛀干害虫在树势衰弱时可迅速侵入落叶松[12]。这些蛀干害虫一旦侵入落叶松能否成为松材线虫的传播媒介、完成侵染循环，有待于进一步研究。落叶松感染松材线虫的症状表现及发生规律等有别于在松属植物上的典型症状和一般规律，也有待进一步观察。松材线虫的媒介昆虫及寄主树种多且杂，应加强对疫区落叶松林病死树的疫情监测，定期开展专项普查，及时开展除治。同时要加大非疫区落叶松林松材线虫及其潜在媒介昆虫的监测预警力度。

国外报道非松属的云杉属Picea9 种、冷杉属Abies7 种、雪松属Cedrus2 种树种均是松材线虫的自然感病寄主和人工接种感病寄主[3]，我国目前虽未发现，但不能排除松材线虫在这些树种上自然发生的可能性，故应加强对所有松科植物的监测。

致谢：宁波出入境检验检疫局顾建锋博士提供显微摄影设备并对本文提出了重要修改意见，深表感谢!