油松内生细菌的分离及拮抗菌的筛选

胡振亮，靳轩，庞久帅，王雪菲，陈孟，李会平

(河北农业大学林学院，河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，河北 保定 071000)

油松枯梢病是一种严重危害油松Pinus tabulaeformis健康的病害，其主要症状为油松枝梢干枯，针叶灰白且不落的现象。该病害于2004年在河北秦皇岛市北戴河联峰山公园首次发现，随着该病的逐年加重，到2014年发病率已达70 %以上，给当地的经济及生态景观造成了极大影响。之后该病害又在保定易县清西陵、承德避暑山庄等地被陆续发现。李会平，王婧等确定该病害的病原菌为半知菌亚门Deuteromycotina 腔孢纲 Coelomycetes 球壳孢目Sphaeropsidales 球壳孢科 Sphaeropsidaceae 球壳孢属SphaeropsisSacc.的球壳孢菌Sphaeropsis sapinea，且首次明确油松为该病原的自然感染寄主[1-2]。任晓婧等对油松枯梢病病原菌越冬及入侵途径进行了研究，确定了该病原菌的入侵途径和越冬方式[3]。2014年和2015年北戴河区政府对联峰山油松主要病虫害进行了连续两年的航空化学防治工作，油松枯梢病得到明显控制，防治后新梢年生长量明显增长[4]。虽然采用化学防治在一定程度上控制了该病害的进一步扩展，但众所周知，化学农药在生产中的大量使用会对环境造成极大破坏，而且化学农药在杀死病原菌的同时，也会杀死环境中的有益微生物。因此，寻找对环境友好的化学农药替代品已成为农业生产和人类可持续发展的迫切要求。生物防治作为一种行之有效的手段，已日益受到人们的重视。

植物内生菌是生活于健康植物的组织和器官内部的真菌或细菌，具有稳定的生存空间，不受外界环境影响等特点。有益的植物内生菌可以有效地防病杀虫、促进植物生长，已成为生物防治中有潜力的微生物农药；它们不仅可以用来防治病虫害，而且在帮助植物本身抵抗不良环境及生物固氮等方面有着重要的生态和生理作用[5-8]。近年来，植物内生菌作为一种生防资源，已经成为被广泛关注的研究热点。很多研究学者对一些生防菌的生物学特性进行深入研究后，对其加以开发应用。郭睿文等从猕猴桃筛选出拮抗菌，对猕猴桃溃疡病病原菌有较强的抑制作用[9]；王美琴等在番茄中筛选出对番茄灰霉病菌和叶霉病菌有拮抗作用的菌株[10]；陈振明 等从红树林分离内生细菌并筛选出对枯萎病菌、炭疽病菌及番茄青枯病菌具有较强抑制作用的拮抗菌，且部分内生菌对番茄生长有促进作用[11]。但关于油松内生细菌的报道较少，本试验主要从油松的植物组织中分离内生细菌，筛选出对油松枯梢病具有拮抗作用的菌株，以期为油松枯梢病防治提供生防菌株和理论基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 材料来源 内生细菌分离用油松松针、松枝、根均于2017年6月和10月采自河北省秦皇岛市联峰山公园。

油松枯梢病病原菌S.sapinea从采自联峰山公园发病区的油松枯梢病的病枝中分离，纯化，保存备用，由河北农业大学林木病理实验室提供。

盆栽试验用5 a 生健康油松苗于2018年6月购买自河北省洪崖山国有林场。

1.1.2 培养基 内生细菌分离和培养采用LB 培养基，病原真菌的培养和拮抗试验采用PDA 培养基。LB 培养基，PDA 培养基参照裴淑兰 等人的配置方法[12]。

1.2 试验方法

1.2.1 内生细菌的分离与纯化 在河北省秦皇岛市联峰山公园，选取3 株30 a 生健康油松，对其1 a生松针、2 a 生松针、1 a 生松枝(韧皮部、木质部)、2 a生松枝(韧皮部、木质部)、根(毛细根)等7 个部位进行采样，共3 个重复，塑封袋带回实验室，标记后置于4 ℃冰箱保存。用无菌水冲洗植物组织表面，清洗掉表面杂物，晾干后，松针剪成10 mm 长的段状，茎部和根部均剪成2.5 mm 长段状，称重后表面消毒。先用75%酒精浸泡30 s，再用0.1%升汞消毒3～5 min，无菌水漂洗5 次，将最后一次冲洗液涂布于平板以检测表面消毒是否彻底。表面消毒完毕后，用消毒后的剪刀和镊子将其剪碎，放入灭菌研钵内，加入灭菌后的石英砂进行研磨，然后置于已经灭菌并加入9 mL 蒸馏水的试管中，在摇床上175 r/min，30 ℃，震荡30 min，形成均匀的植物组织溶液。将植物组织溶液加无菌水稀释10 倍，再依次稀释5 次，将各浓度梯度的稀释液均取100 μL，分别涂布于 LB 平板上，置于28 ℃恒温培养箱培养[13-15]。培养1 d 后，观察菌落生长情况，以形态特征为判断依据。挑取单个菌落接种于LB 平板上进行纯化，以获得单一菌种。然后采用50%甘油悬液保藏法，-80 ℃保存菌种。

1.2.2 拮抗菌的筛选 初筛，采用平板对峙法，以油松枯梢病病原菌为靶标，分别在含有25 mL 的PDA 平板(直径90 mm)中央放置生长旺盛的油松枯梢病病原菌菌碟(直径6 mm)，在其四周接种生长旺盛的内生菌菌碟，每个菌碟距离病原菌中心2.6 cm，每个处理重复3 次，以平板中心仅放病原菌菌碟为对照，28 ℃恒温培养，每天测量处理组和对照组菌落半径，计算抑菌率。

复筛，将经过初筛获得的的菌株再次转接入LB平板上活化，1 d 后将菌株接种于LB 液体培养基中，160 r/min，37 ℃摇床培养 24 h；然后将培养液8 000 r/min，4 ℃，离心 5 min；取上清液，用 0.2 μm微孔滤膜过滤备用。在PDA 平板中央接种油松枯梢病病原菌菌碟，并在距离平板中心2.6 cm 处用打孔器打2 个孔，然后将菌株发酵上清液50 μL 注入孔内，3 个重复，以孔内注射LB 液体培养基为对照组，28 ℃恒温培养，每天测量处理组和对照组菌落半径，计算抑菌率[16-18]。

1.2.3 拮抗菌AM-5 对油松枯梢病病原菌孢子萌发的影响 将拮抗菌在LB 培养基上活化，培养1 d后，用无菌水冲洗菌落，借助分光光度计，根据浓度关系曲线，将菌悬液配成1 ×108cfu/mL 的浓度。油松枯梢病病原菌孢子由采集的发病松针中获得，孢子悬浮液配备参照任晓婧 等方法[19]，用血球计数板计数，将孢悬液配成1 ×106个/mL 的浓度。将AM-5 菌悬液和病原菌孢子悬浮液以1 ∶1 混合(2 mL∶2 mL)于无菌离心管中，以等体积无菌蒸馏水为对照，3 个重复，黑暗25 ℃分别放置2，12，24 h后进行镜检，每个载玻片观察5 个视野，以萌发出的芽管长度大于孢子短轴一半时记为萌发，记录孢子萌发数量，计算孢子萌发率[1，20-21]。

孢子萌发率(%) ＝孢子萌发数/孢子总数×100

1.2.4 拮抗细菌鉴定

1.2.4.1 菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定 将拮抗菌株AM-5 划线接种于LB 培养基上，28 ℃培养24 h，观察并描述其形态特征，同时取少量菌落进行革兰氏染色及芽孢染色等，具体操作方法参照方中达等人[22]，并参照《常见细菌系统鉴定手册》进行生理生化鉴定，另外，部分生理生化项目由青岛科创质量检测有限公司进行鉴定。

1.2.4.2 16S rDNA 序列分析鉴定 菌株AM-5总DNA 的提取采用DNA 提取试剂盒，购自上海桑尼生物科技有限公司。PCR 扩增采用细菌通用引物 27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)，1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。

反应体系50 μL 包含:基因组 DNA(20 ng/μL)1.0 μL，Buffer 5.0 μL，Taq 酶 1.0 μL，dNTP 1.0 μL，引物 27F(10 μM)1.5 μL， 引物 1492R(10 μM)1.5 μL，ddH2O 39.0 μL。PCR 扩增反应程序:95 ℃预变性5 min， 95 ℃变性30 s， 58 ℃退火30 s，72 ℃复性90 s，共 35 个循环，最后 72 ℃延伸7 min。PCR 产物经纯化后交上海桑尼生物科技有限公司进行测序。将测得序列在NCBI 网站进行16S rDNA 序列同源性比较，然后用软件MEGA 5.0 以邻位法构建系统发育树，进行系统进化分析。

1.2.5 盆栽试验

1.2.5.1 拮抗菌悬浮液及病原菌孢子悬浮液的配备 将拮抗菌AM-5 从冷冻冰箱取出，待解冻后，采用涂布平板法在LB 平板上活化拮抗菌株，培养5-10皿备用；待培养出菌落后，超净台中用无菌水冲洗菌落，移液枪吸冲多次使菌悬液充分混匀，制成细菌悬浮液，然后利用分光光度计，根据浓度关系曲线，将细菌悬浮液配成1 ×108cfu/mL 的浓度。油松枯梢病病原菌孢子由采集的发病松针中获得，孢子悬浮液配备参照任晓婧 等方法[19]，将孢悬液配成 1 ×106个/mL 的浓度。

1.2.5.2 拮抗菌AM-5 对油松枯梢病的预防试验取10 株健康且长势一致的5 a 生油松苗，每棵苗选择3 个长势一致的侧枝，每个侧枝标记50 个松针用于试验。处理组为先接种浓度为1 ×108cfu/mL的拮抗菌悬浮液，2 h 后接种浓度为1 ×106个/mL病原菌孢悬液；对照组为先接种无菌水后接种病原菌的处理(无菌水+病原菌)和单独接种拮抗菌的处理为对照，测定该拮抗菌对油松枯梢病的预防作用。每个处理设置10 个重复。病原菌和拮抗菌均采用浸泡法接种，将松针完全浸在已配好的拮抗菌菌悬液或病原菌孢悬液中30 s，用塑料袋罩上接种植株进行保湿处理48 h。将处理后的油松苗置于25 ℃室温培养，每天观察发病情况，14 d 后统计发病率，计算预防效果。

发病率(%) ＝发病松针/调查总松针数×100

预防效果(%) ＝(对照组发病率-处理组发病率)/对照组发病率×100

1.2.5.3 拮抗菌AM-5 对油松枯梢病的防治试验取10 株健康且长势一致的5 a 生油松苗，每棵苗选择2 个长势一致的侧枝，每个侧枝标记50 个松针用于试验。处理组为先接种浓度为1 ×106个/mL的病原菌孢悬液，7 d 后统计发病率[19]，然后接种浓度为1 ×108cfu/mL 的拮抗菌悬浮液，3 d 后再接1次拮抗菌悬浮液。对照组为先接种病原菌孢悬液后接种无菌水。每个处理设置10 个重复。拮抗菌和病原菌接种方式均同预防试验。将处理后的油松苗置于25 ℃室温培养，每天观察病害发展情况，14 d后再次统计发病率，计算防治效果。

防治效果(%) ＝(对照组发病率增加值-处理组发病率增加值)/对照组发病率增加值×100

1.2.6 数据分析 用Excel 软件对统计结果进行计算和作图，用SPSS 软件进行显著性方差分析。

2 结果与分析

2.1 拮抗细菌的分离与筛选 根据菌落形态、颜色、大小、表面光滑度等，从油松不同组织中共分离并纯化得到内生细菌40 株。分别从健康油松1 a生松针、2 a 生松针、1 a 生松枝韧皮部、1 a 生松枝木质部、2 a 生松枝韧皮部、2 a 生松枝木质部、根，分离到内生细菌 3，8，4，6，5，6，8 株。以油松枯梢病菌为指示菌，通过平板对峙培养，筛选出3 株拮抗作用较强的菌株，编号分别为AZ-3(分离于1 a 生松针)，QZ-3(分离于2 a 生松针)，AM-5(分离于 1 a 生松枝木质部)，菌株的抑菌率分别为 39.72%，31.83%，66.95%；在拮抗菌发酵液对峙试验中，菌株AM-5 的发酵液对油松枯梢病病原菌的生长有一定抑制作用，为27.89%(图1，表1)。

图1 拮抗菌AM-5 及其发酵液与油松枯梢病病原菌对峙培养3 d 菌落形态

表1 不同拮抗菌及其发酵液3 d 时对油松枯梢病病原菌的抑制作用

2.2 拮抗菌AM-5 对油松枯梢病病原菌孢子萌发的影响 无菌水处理的病原菌孢子2，6，12 h 后萌发率分别为34%，9.33%，49.67%，当无菌水持续处理至24 h 时，其萌发率达72.33%；与对照组相比，拮抗菌菌悬液处理的病原菌孢子萌发率显著降低，当用菌悬液持续处理至24 h时，其萌发率仅为30.5%，说明拮抗菌菌悬液对病原菌孢子萌发具有显著的抑制作用(表2)。

表2 拮抗菌AM-5 处理不同时间对油松枯梢病病原菌孢子萌发的影响

2.3 内生拮抗菌的分类鉴定

2.3.1 菌体形态特征及生理生化指标 拮抗菌株AM-5 在LB 培养基上菌落为乳白色，表面干燥有褶状隆起，与培养基结合牢固，质地致密不透明；革兰氏反应为阳性；菌体杆状，大小为(2.3～2.5)μm×(0.7～0.8)μm，周生鞭毛，产芽孢，无荚膜；可在6.5%NaCl 生长；V-P 反应呈阳性。菌株符合芽孢杆菌的生理生化特性(表3)。

表3 菌株AM-5 的生理生化特征

2.3.2 16S rDNA 序列分析与系统进化树 以AM-5菌株基因组为模板，经16S rDNA 特异性引物PCR 扩增后得到一条大小约为1 500 bp 的序列。序列全长为1 474 bp，在NCBI 上与己知序列比对结果显示菌株AM-5 与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(GenBank 登录号:CP032855.1)的序列相似性为100%。采用邻接法(NJ 法)构建菌株 AM-5 16S rDNA 序列系统发育树(图2)。

结合该菌株的培养特征、形态和生理生化特征及16S rDNA 序列分析结果，将菌株AM-5 鉴定为枯草芽孢杆菌B.subtilis。

图2 基于16S rDNA 序列构建的菌株AM-5 系统发育树

2.4 拮抗菌对油松枯梢病的盆栽预防和防治效果

2.4.1 预防作用 接种油松枯梢病菌7 d 后，对照组(无菌水+病原菌)开始发病，10 d 后症状明显，发病松针枯黄，14 d 时发病率达75.63%。处理组(拮抗菌+病原菌)的松针发病较缓，少数松针有发病迹象，14 d 时发病率为27.03%。菌株AM-5 对油松枯梢病的预防效果为64.26%(表4)。单施拮抗菌组松针生长正常，没有明显变化，说明拮抗菌对松针生长几乎无影响。

2.4.2 防治试验 处理组和对照组健康松针经施用病原菌7 d 后开始发病，此时处理组发病率为28.33%，对照组发病率为28.60% 。处理组(病原菌+拮抗菌)再经拮抗菌处理7 d 后，发病情况进展较慢，发病率为48.73%；对照组(病原菌+无菌水)再经无菌水处理7 d 后，松针发病进展迅速，发病率达72.36%。菌株AM-5 对油松枯梢病的防效为53.38%(表5)。

表4 拮抗菌AM-5 对油松枯梢病的预防效果

表5 拮抗菌AM-5 对油松枯梢病的防治效果

3 结论与讨论

从健康油松植物组织中分离出内生细菌40 株，以油松枯梢病病原菌为指示菌，获得1 株拮抗作用较强的菌株AM-5。基于形态特征、理化特性和分子生物学等方法鉴定该菌为枯草芽孢杆菌B.subtilis。盆栽试验表明，该菌株对油松枯梢病有良好的预防和防治作用，其预防效果和防治效果分别为64.26%和53.38%。

目前已有大量关于芽孢杆菌的报道，相关研究表明，植物内生芽孢杆菌具有在植物内部稳定生存并繁殖的能力，易于在植物内形成较大的群体，对植物病害有显著的拮抗性。何红 等在辣椒中分离到的枯草芽孢杆菌BS-2，对辣椒炭疽病有较强的防病效果[23]；谢学文筛选得到的甲基营养型芽孢杆菌WF-3 对黄瓜炭疽病菌显示出了很好的抑制活性[24]；陈奕鹏在木薯中分离到类芽孢杆菌属菌株对木薯细菌性萎蔫病有较强的抑制性，并在田间防控上有明显的效果[25]。本研究中分离获得枯草芽孢杆菌AM-5，对油松枯梢病菌有明显的抑制性，盆栽防治试验中也有较显著的效果，可为油松枯梢病的生物防治提供生防资源和理论依据，但该菌株的田间防治效果以及定殖能力、抑菌机制等还有待进一步研究。从现有研究结果来看，相对于AM-5菌体，其发酵液的抑菌作用较弱，说明其抑菌的主要成分在菌体中，但也不排除与发酵液浓度、发酵时间等有关，因此可进一步优化发酵条件、探索发酵液的抑菌作用，以便为田间应用提供更多、更方便的菌剂剂型。