衍生合成七种氮杂糖成分及其抑制α-葡萄糖苷酶构效关系分析

晏仁义，李琼娅，徐 冰*，陈若芸

1中国医学科学院 & 北京协和医学院药物研究所，北京 100050；2华润三九医药股份有限公司研发中心，深圳 518110

氮杂糖(azasugar)又称多羟基生物碱(polyhydroxy alkaloid)、亚氨基糖(iminosugar)和糖型生物碱(sugar-mimic alkaloid)等，指糖环上氧原子被氮原子取代而形成的一类化合物。药理学研究已经证实多羟基生物碱具有高效的糖苷酶和糖基转移酶抑制活性，糖苷酶和糖基转移酶在肠道的消化、糖蛋白加工、溶酶体代谢等生理过程中起着十分重要的作用，因此多羟基生物碱具有抗糖尿病、抗癌、抗病毒、治疗溶酶体贮积症等多种药理活性。1996年作为α-葡萄糖苷酶抑制剂治疗Ⅱ型糖尿病的米格列醇片开发成功。2003年ZavescaTM上市，为第一个口服治疗戈谢病的药物。使得这一研究领域具有重要前景，吸引了广大学者的兴趣。出版的专著和综述，从不同方面对多羟基生物碱进行了报道[1-6]。

α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制肠黏膜上的α-葡萄糖苷酶，减缓淀粉分解为葡萄糖的速度，减少和延缓小肠对葡萄糖的吸收，降低血糖浓度，对餐后高血糖的降低作用比较明显。同时不刺激胰岛素的分泌，单独使用通常不会引发低血糖。是治疗无明显空腹高血糖，以餐后血糖升高为主的Ⅱ型糖尿病患者的常用药。目前临床上常用的药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇等[7]。

白树(Suregadaglomerulata)为大戟科白树属(Suregada，又名Gelonium)植物。本组对白树进行了较为深入的研究，发表了系列论文。尤其是阐明了其糖苷酶抑制活性的物质基础，得到一系列结构新颖的多羟基生物碱[8-10]，为开发该植物提取物来源的降血糖天然药物打下坚实基础。本研究在以前的基础上，对分离得到的五个氮杂糖的N上进行了衍生，并分析对其活性的影响。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker Avance 300 MHz，Bruker Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振仪，D2O为溶剂(加DSS为内标)。强酸型阳离子交换树脂Dowex 50×4-400及强碱型阴离子交换树脂Dowex 1×2-400和弱酸性阳离子交换树脂Amberlite CG-50为百灵威试剂公司进口分装。水为市售去离子水。所用试剂甲酸、甲醛、溴代丁烷、碘化钾、无水碳酸钾、氨水、盐酸及氢氧化钠均为分析纯，北京化工厂生产。30%过氧化氢为分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产。TLC显色剂配制：1% KI溶液7.5 mL和o-tolidine溶液(o-tolidine 1 g溶于2 %乙酸溶液250 mL中)17.5 mL混合。

1.2 化合物衍生合成

1.2.1 N-甲基化衍生物的制备

5-O-α-D-galactopyranosyl-α-homonojirimycin和6-deoxy-homoDMDP分别用0.2 mL水溶解，加入37%的HCHO溶液0.8 mL，80 %的HCOOH溶液0.8 mL，80 ℃反应5小时，蒸干。用水溶解，过Dowex 50×4-400(H+)强酸性阳离子树脂柱(20 mL)，40 mL蒸馏水洗后，用40 mL的0.5 M的氨水洗，收集氨水洗脱部分，蒸干。水溶解，过Dowex 1×2-400(OH-)强碱性阴离子树脂柱纯化(10 mL)，收集蒸馏水洗脱部位(20 mL)，蒸干即得[11]。分别得到化合物6和7。

1.2.2 N-丁基化衍生物的制备

α-4-deoxyhomonojirimycin用0.2 mL DMF溶解，加入适量溴代正丁烷50 μL和0.15 g无水K2CO3，将混合物加热到100 ℃，反应24 h。过滤，将滤液过Dowex 50×4-400(H+)强酸性阳离子树脂柱(20 mL)，40 mL蒸馏水洗后，用40 mL的0.5 M的氨水洗，收集氨水洗脱部分，蒸干。水溶解，经Dowex 1×2-400 (OH-)强碱性阴离子树脂柱纯化(10 mL)，蒸馏水洗脱，TLC检测，收集纯化部位，蒸干即得化合物1[12]。

1.2.3 N-氧化衍生物的制备

N-methyl-α-7-deoxyhomonojirimycin和N-methyl-α-homonojirimycin分别用0.1 mL的H2O溶解，加入30%双氧水3.0 mL，室温搅拌，反应3天，蒸干即得化合物3和5[13]。

1.2.4 N,N-二甲基化衍生物的制备

N-methyl-α-4-deoxyhomonojirimycin和N-methyl-α-7-deoxyhomonojirimycin用0.1 mL的DMF溶解，加入MeI(0.5 mL)，室温搅拌，反应12 h，蒸干。1 mL水溶解后用Dowex 1×2-400 (OH-) 强碱性阴离子树脂柱纯化[14]。蒸干即得化合物2和4。

1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性测试

从小鼠小肠获得的糖苷酶溶液(100 μL)与化合物的各种浓度溶液(0.01～40.00 mol/L)80 μL混合，然后加入20 μL的100 mg/mL蔗糖的磷酸盐缓冲液(pH6.0)，开始反应。在37 ℃下，温孵30分钟后，在80～85 ℃下温孵3分钟终止反应。取其中5 μL加入195 μL葡萄糖氧化酶(GOD)测定酶液，37 ℃温孵40 min，在酶标仪上测定505 nm处的吸光度，以葡萄糖的生成量计算α-葡萄糖苷酶的活性；同时设定空白对照，阳性对照(Acarbose)。根据不同浓度下的抑制率计算半数有效抑制浓度IC50。酶的抑制率通过以下公式计算：(ODreaction-ODsample)/(ODreaction- ODblank)× 100%。IC50值表示在测量条件下50 %酶被抑制的抑制剂浓度，根据样品各种浓度下的抑制率来计算IC50值。

2 结果

2.1 化合物的结构鉴定

化合物1～7均通过衍生合成得到，衍生的底物结构明确。因此，通过测试1H NMR、13C NMR和MS的数据确定衍生合成的新成分的结构，结构见图1。

图1 化合物1～7的结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测试结果

按照1.3中的方法对化合物1～7的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行测试，结果见表1。

3 讨论

本课题组前期发表的论文中指出[8]，哌啶烷类的氮杂糖如α-4-deoxyhomonojirimycin和α-7-deoxyhomonojirimycin的N-甲基化衍生物能显著增强α-葡萄糖苷酶抑制活性。然而本研究结果表明这两个化合物氮上其他衍生物(化合物1～4)的活性未见增强。化合物5具有一定的抑制活性，但是与氮上未氧化的母体化合物相比(IC500.08 μmol/L)活性降低了不少。化合物6的数据表明不是所有的哌啶烷类氮杂糖N-甲基化衍生物能增强活性。化合物7属于吡咯烷类氮杂糖，同样N-甲基化衍生物也未增强活性，这也与前期的报道结果一致[8]；体内外活性都较强的homoDMDP(IC500.92 μmol/L)，其N-甲基化衍生物活性降低较多(IC50> 40 μmol/L)。哌啶烷类N上丁基取代生成叔胺不能增强活性，说明合适碳链的取代基对活性重要；生成季铵后活性降低，可能与位阻有关；本实验结果为进一步开展此类化合物的结构改造提供了参考。

表1 化合物1～7的α-葡萄糖苷酶抑制活性Table 1 Effect on α-glucosidase of compounds 1-7