虎杖苷对脂多糖介导的肺泡上皮细胞线粒体损伤的影响

邓加雄，王香，李桂成，李云峰

(湖南省郴州市第一人民医院重症医学科，郴州 423000)

急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是临床上常见的危重症，由于其治疗药物相对缺乏，具有极高的死亡率[1-3]，因此研究缓解ALI的有效药物具有重要的临床意义。虎杖苷是从中药虎杖的根茎中提取的单体，在抗休克、炎症及治疗烧伤方面有显著作用[1,2,4]。我们的前期研究表明[5]，虎杖苷可以减轻脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)介导的ALI中细胞凋亡及炎症反应，但机制并不明确。另有研究表明，线粒体损伤是ALI发病过程中的重要环节，抑制线粒体损伤可以减轻ALI发病[6,7]。而虎杖苷可以通过激活沉默信息调节因子2相关酶3(silent information regulator 2 related enzyme 3,SIRT3)保护线粒体，从而减轻失血性休克导致的肠损伤[4]。我们假设虎杖苷可通过SIRT3抑制线粒体损伤改善ALI，并通过LPS刺激A549细胞模拟ALI的体外实验加以验证，探讨虎杖苷对LPS介导的线粒体损伤的影响，并进一步分析SIRT3在其中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

荧光素-荧光素酶试剂盒购自美国Promega公司；线粒体膜电位JC-1探针及钙黄绿素-氯化钴购自美国Sigma公司；DCFH-DA活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光探针购自上海碧云天公司；细胞计数试剂盒 (cell count kit-8,CCK-8)购自上海Dojindo公司；SIRT3单克隆抗体、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国ABclonal公司；A549细胞购自广州赛库生物公司。

1.2 分组及处理

将A549细胞分为4组(n=6)：对照组为细胞仅接受0.1% DMSO处理7 h；模型组为细胞给予DMSO预处理，1 h后与LPS(5 mg/L)[3]共孵育6 h；治疗组为细胞接受虎杖苷(50 μmol/L)[8]预处理，1 h后与LPS(5 mg/L)共孵育6 h；抑制剂组为细胞接受SIRT3抑制剂(50 μmol/L 3-TYP)[9]及虎杖苷50 μmol/L预处理，1 h后与LPS(5 mg/L)共孵育6 h。

1.3 细胞活性检测

在96孔板中接种200 μl的细胞悬液，根据实验分组，细胞经过不同条件处理后弃上清，加入10 μl的CCK-8溶液及培养液，继续孵育2 h后酶标仪检测A450 nm值，并以对照组进行标准化。

1.4 细胞ATP含量测定

采用荧光素-荧光素酶法检测线粒体腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)水平。将细胞悬液加入96 孔白板，每孔100 μl(约2×104个细胞)。于室温下加入等体积的CellTiter-Glo 检测试剂，混匀细胞，并孵育10 min，用Spectra Max M5酶标仪检测荧光强度，并以对照组标准化。

1.5 细胞线粒体通透性转变孔状态检测

通过钙黄绿素-氯化钴检测线粒体通透性转变孔(mitochondria permeability transition pore,mPTP)状态。各组细胞经不同处理后，加入1 ml(浓度为1 μmol/L)染色工作液，并混合均匀，在37℃振荡器中孵育10 min后，用Spectra Max M5酶标仪检测荧光强度(激发波长488 nm，发射波长530 nm)。荧光强度下降表明mPTP开放，荧光强度增加表明mPTP开放被抑制。

1.6 细胞ROS检测

采用DCFH-DA ROS荧光探针检测细胞ROS水平。各组细胞经不同处理后与5 μmol/L浓度的DCFH-DA工作液在37℃下共孵育10 min，酶标仪检测荧光强度，并且在荧光显微镜下观察细胞荧光，并以对照组标准化。

1.7 细胞线粒体膜电位测定

各组细胞处理后经PBS缓冲液洗涤，重悬，与荧光探针JC-1(工作浓度5 μmol/L)在37℃孵育15 min后共聚焦显微镜下观察。以红色与绿色荧光的比值来衡量线粒体去极化的程度，并以对照组进行标准化。比值越高表明线粒体去极化降低，线粒体膜电位(mitochondria membrance potential,MMP)增加，反之则去极化增加，膜电位下降。

1.8 SIRT3含量测定

Western blotting检测SIRT3表达水平。各组细胞充分裂解，凝胶电泳后转膜，免疫化学发光法曝光并进行灰度值分析。以目的蛋白与内参三磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的灰度值比值表示目的蛋白相对表达量，并以对照组进行标准化。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 4组细胞ATP水平、细胞活性及钙黄绿素荧光强度比较

与对照组比较，模型组、治疗组及抑制剂组细胞中ATP、细胞活性及钙黄绿素荧光均显著下降 (P<0.05)；与模型组比较，治疗组细胞上述指标均显著增加(P<0.05)；与治疗组比较，抑制剂组细胞上述指标又显著下降(P<0.05；表1)。

表1 4组细胞ATP水平、细胞活性及钙黄绿素荧光强度比较

Table 1 Comparison of ATP level, cell activity and calcein fluorescence intensity among four groups (n=6,

ATP: adenosine triphosphate; mPTP: mitochondria permeability transition pore. Compared with control group,*P<0.05; compared with modol group,#P<0.05; compared with treatment group,△P<0.05.

2.2 4组细胞ROS水平比较

与对照组(100.0±6.3)%比较，模型组、治疗组及抑制剂组细胞ROS水平均显著增加(P<0.05)，依次为(218.0±21.7)%、(180.0±18.1)%和(212.2±18.2)%。与模型组比较，治疗组ROS水平显著下降(P=0.001)；与治疗组比较，抑制剂组ROS水平又显著增加(P=0.003；图1)。

2.3 4组细胞MMP比较

与对照组[(100.0±7.2)%]比较，模型组、治疗组及抑制剂组细胞MMP均显著下降(P<0.001)，依次为(54.0±6.5)%、(75.8±7.6)%和(62.8±6.2)%；与模型组比较，治疗组细胞MMP显著增加；与治疗组比较，抑制剂组细胞MMP又显著下降 (P=0.004；图2)。

图1 DCHF-DA法检测4组细胞ROS水平

图2 JC-1法检测4组细胞MMP变化

2.4 4组细胞SIRT3表达比较

与对照组(100.0±11.8)%比较，模型组、治疗组及抑制剂组细胞SIRT3表达显著下降(P<0.05)，依次为(73.3±4.5)%、(86.7±7.6)%和(69.0±7.8)%；与模型组比较，治疗组SIRT3表达显著增加；与治疗组比较，抑制剂组SIRT3表达又显著下降，差异均有统计学意义(P<0.05；图3)。

图3 Western blotting检测4组细胞SIRT3表达

3 讨 论

ALI是创伤、感染等临床危重症的常见并发症之一，具有非常高的死亡率，因此一直是临床工作中的棘手问题[3]。我们前期研究证实，虎杖苷可以通过抑制细胞凋亡及炎症反应减轻LPS介导的ALI，但机制尚未明确[5]。线粒体是普遍存在于真核生物的细胞器，因生命活动所需的绝大多数能量都依赖于线粒体的合成，因此有细胞的“动力工厂”之称。不仅如此，线粒体还在自由基形成、细胞信息传递、中间代谢产物转化及内源性凋亡途径的启动调节中发挥重要作用[10,11]。研究证实，肺泡上皮细胞线粒体损伤是ALI的重要发病机制，线粒体可以通过调节细胞凋亡及炎症反应参与ALI[6,12]。而大量研究证实，虎杖苷可以通过抑制线粒体损伤，在抗休克及抗炎症中发挥作用[1,13]。因此，本研究中探讨了虎杖苷对肺泡上皮细胞线粒体的影响。

线粒体功能不全通常是由mPTP开放引起[14]。在病理情况下，mPTP激活开放，允许<1.5 ku的小分子物质自由出入，此时线粒体内外的电荷梯度减小，线粒体跨膜电位降低;另外电子传递链复合酶质子泵功能发生障碍时，H+泵入线粒体膜间隙不足同样也会引起线粒体跨膜电位降低[13,15]。在本研究中，我们通过钙黄绿素-氯化钴检测mPTP开放情况及膜电位去极化现象。正常情况下，钴离子不能穿透线粒体膜，但在mPTP开放时，钴离子可以自由进入线粒体，淬灭线粒体内的钙黄绿素荧光。我们的结果显示，LPS刺激导致细胞钙黄绿素荧光减弱，提示mPTP开放，而虎杖苷可以抑制LPS介导的mPTP开放。膜电位是维持线粒体正常功能的电位，正常线粒体是处于电压内负外正的极化状态，是由质子泵将H+由内膜泵出到膜间隙所致，但在mPTP开放时，因为小分子物质(如H+)可以自由出入线粒体，使线粒体内外的电荷梯度减小，跨膜电位降低[16]。我们的研究结果显示，虎杖苷可以显著抑制LPS介导的线粒体膜电位下降，这也与我们起初的假设是一致的。其次，线粒体是ATP生成的主要细胞器，本研究检测了细胞的ATP水平，结果发现LPS刺激后的细胞ATP水平显著下降，而虎杖苷可以使细胞内ATP水平得到显著恢复，提示虎杖苷可以缓解线粒体损伤。再者，当线粒体损伤，电子传递链发生障碍后，线粒体生成ROS增多，此时堆积的ROS将线粒体DNA及mPTP作为靶点，反过来加重线粒体损伤。由此我们又检测了细胞内ROS水平，结果发现虎杖苷同样可以抑制LPS介导的ROS生成增加。基于以上结果，本研究认为虎杖苷可以显著改善LPS介导的线粒体功能障碍。进一步地，我们探讨了虎杖苷减轻线粒体损伤的可能机制。

SIRT3是线粒体主要的去乙酰化酶，可通过调节线粒体代谢关键酶的乙酰化水平，参与线粒体代谢及生成等，因此调控SIRT3可能作为治疗线粒体损伤的作用靶点[17,18]。本课题组既往研究证实，大鼠休克后，内皮细胞内SIRT3表达下调，但上调SIRT3可以促进细胞自噬，抑制内皮细胞线粒体凋亡信号的激活[9]。同时SIRT3也可以通过修饰呼吸链复合体减轻线粒体损伤[19]。本次研究发现LPS刺激导致肺泡上皮细胞SIRT3表达显著下降，而虎杖苷可以显著提高SIRT3水平表达。研究证实，休克后线粒体锰超氧化物歧化酶(SOD2)乙酰化水平增加，导致线粒体ROS清除能力下降，而虎杖苷可以通过激活SIRT3，提高SOD2去乙酰化，清除ROS，发挥线粒体保护作用，从而改善失血性休克中的小肠损伤[4]。也有研究表明，虎杖苷可以通过SIRT1调节SOD2乙酰化修饰，抑制线粒体损伤，减轻失血性休克中肝细胞损伤[20]。本研究结果发现SIRT3抑制剂3-YTP可以逆转虎杖苷对线粒体的保护作用，提示虎杖苷可能通过激活SIRT3改善了LPS介导的线粒体功能障碍，但关于虎杖苷上调SIRT3的机制尚需进一步研究。

综上，虎杖苷可以显著改善LPS介导的肺泡上皮细胞线粒体功能障碍，而这有可能与虎杖苷激活SIRT3有关。