慢性咳嗽患者自然咳痰与诱导咳痰细胞学分析结果比较

陈桥丽 易芳 罗炜 唐玉芳 赖克方

在国内慢性咳嗽患者约占呼吸科门诊病人三分之一以上[1]。痰液细胞学检测对慢性咳嗽患者的诊治意义重大，例如：痰液中嗜酸粒细胞（Eos）比例增高是嗜酸粒细胞性支气管炎的主要诊断依据，也是咳嗽变异型哮喘和哮喘的辅助诊断依据[1]，并可为糖皮质激素治疗效果评估提供客观依据。在临床工作中，痰液细胞学检测可通过自然咳痰或诱导咳痰方法获得痰液样本进行检测，多数呼吸道疾病患者可通过自然咳痰进行痰液细胞学检测，仍有相当多的病人需要进行诱导咳痰进行痰液细胞学检测。然而，自然咳痰法或诱导咳痰法获取痰液样本的途径不同，可能会影响痰液细胞分析结果，从而可能会误导呼吸道疾病的诊治。本研究收集在我院呼吸科门诊就诊的慢性咳嗽患者，比较自然咳痰法和诱导咳痰法对痰液细胞总数、分类计数和细胞存活率检测的差异，现报告如下。

1 临床资料

1.1 研究对象（1）入选标准：慢性咳嗽（咳嗽时长大于8 周），能够自主咳痰，胸部X 光检查正常。（2）排除标准：咳嗽时长少于8 周，不能自主咳痰，胸部X 光检查异常。随机纳入2008年2月至2009年6月在广州医科大学附属第一医院呼吸科门诊就诊的慢性咳嗽患者，检查前，向每位入选患者详细解释操作步骤并取得知情同意，分别通过自然咳痰和诱导咳痰法获得痰液样本，将痰液中Eos 百分比≥2.5%定义为Eos 增高[2]。

1.2 痰液样本合格标准参考Popov 等[3]和Spanevello等[4]报道，痰液样本必须符合以下全部标准：（1）低唾液污染，细胞涂片口腔鳞状上皮细胞比例≤20%；（2）细胞存活率＞50%；（3）细胞涂片细胞总数＞400 个。

1.3 痰液样本收集与处理痰液收集与处理根据 Popov 等[3]和 Spanevello 等[4]的报道方法进行适当改良。痰液收集：患者使用蒸馏水漱口、擤鼻、吐干唾液后，用力咳嗽咳痰，咳出的痰液置于无菌培养皿中。随后坐位，给予3%高渗盐水经超声雾化仪雾化吸入10 min，嘱患者雾化期间正常呼吸，若出现呼吸困难、心率加快等不适，及时终止诱导，监测外周血氧饱和度，给予沙丁胺醇200 ug 吸入，必要时给予氧气吸入，观察10 min，待症状与生命体征均恢复正常后，方可离开。雾化10 min后，患者使用蒸馏水漱口、擤鼻、吐干唾液，用力咳嗽咳痰，咳出的痰液置于无菌培养皿中。观察并记录前后两次痰液样本的顔色和性状，顔色分为无色透明、白色、黄白色、黄色，性状分为黏液痰、黏稠痰、脓痰、胶冻样痰。痰液处理：将无菌培养皿中的痰液与唾液分离，挑选不透明和密度较高的部分痰液置于预先称重的Eppendorf 试管中，痰液使用电子天平称重。收集样本后，在2 h 内完成以下实验，痰液样本分别加入四倍体重的0.1%二硫苏糖醇，漩涡震荡至痰液悬浮后，置于37℃水浴箱中，水浴10 min，水浴期间每隔3 min 将样本取出漩涡震动3-5 s，10 min 后痰液得到充分裂解。使用300 目（48 um）的尼龙滤布过滤杂质，过滤后留取100 μl 细胞悬液，进行细胞总数计数和台盼蓝排斥试验。其余细胞悬液经3000 r/min 离心10 min，离心后弃去上清液，细胞沉淀涂片，细胞涂片自然风干后，置中性甲醛液中固定。细胞涂片经苏木精-伊红（HE）染色，65℃恒温烤箱脱水20 min，中性树脂盖玻片封固。

1.4 痰液细胞分析（1）细胞总数：准备经无水酒精清洁的血球计数板及专用盖玻片，用100 μl移液器轻轻吹打细胞悬液，取10 μl 细胞悬液，在计数板上盖玻片一侧滴入，加样时不能溢出盖玻片及两侧玻璃槽内，不能过少或带气泡。在20 倍物镜下计数四角大方格中的细胞数，细胞压中线时，只计左侧和上方，不计右侧和下方，遇见2 个以上细胞组成团时，按单个细胞计数，计算细胞总数。（2）台盼蓝排斥试验：在20 μl 细胞悬液中加入20 μl 0.4%台盼蓝溶液，混匀，在3 min 内用血球计数板分别计数活细胞量和死细胞量，计算细胞存活率。（3）细胞涂片分类计数：在400 倍光镜下对每张细胞涂片随机选择每视野（固定视野）20 个细胞，共计数300-400 个炎症细胞（嗜酸粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞），计算各种细胞的比例。

1.5 统计学分析采用McNemar-Bowker 检验两种方法的痰液颜色、性状；由于痰液细胞总数、分类计数和存活率检测数据均为非正态分布数据，因此，采用中位数（四分位间距）表示。通过计算组内相关系数（Intraclass correlation coefficient，ICC）检验两种痰液分析方法结果的一致性。两种方法的痰液细胞总数、分类计数和存活率比较采用Mann-Whitney U 检验。所有统计学分析采用SPSS13.0 软件包进行，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病例入选共筛选78 例患者，剔除18 例（12 例患者的X 线检查结果异常；3 例患者的自然痰细胞涂片口腔鳞状上皮细胞比例＞20%；1 例患者自然痰样本的细胞存活率＜50%；1 例患者的诱导痰细胞涂片细胞总数＜400 个；1 例患者雾化诱导后无痰，诱导失败）。最终纳入研究60 例，其中男 21 例，女 39 例；平均年龄 41.8±14.2 岁。全部患者的痰液样本均进行细胞总数和分类计数，其中37 例患者的痰液样本进行细胞存活率检测。60例患者诊断：哮喘21 例（35.0%）、嗜酸粒细胞性支气管炎5 例（8.3%）、其他原因引起的慢性咳嗽34例（56.7%）。

2.2 痰样本的基本情况60 例患者的自然痰液样本重量为：208±59 mg，诱导痰液样本重量为：253±104 mg。痰样本颜色变化：60 例患者中，17 例（28.3%）患者自然咳痰的痰液颜色为黄色或黄白色，经诱导咳痰后其中13 例（21.7%）变为白色，余4 例（6.7%）仍为黄色或黄白色；40 例（66.7%）患者自然咳痰的痰液颜色为白色，其中38 例（63.3%）经诱导咳痰后患者痰液颜色无改变，余1 例（1.7%）变为无色透明，1 例（1.7%）变为黄色；3 例（5.0%）患者前后两次痰液均为无色透明。60 例中，42 例（70%）患者前后两种方法的痰液颜色无改变，18 例（30%）患者前后两种方法的痰液颜色有改变。痰样本性状变化：50 例（83%）患者前后两种方法的痰液性状无改变，10 例（17%）患者前后两种方法的痰液性状有改变。自然咳痰与诱导咳痰法的痰液颜色改变有统计学差别（χ2=12.133，P=0.016），而痰液性状无统计学差别（χ2=2.667，P=0.446）。

2.3 痰液细胞学分析自然咳痰和诱导咳痰的痰液细胞学分析结果见表1。4 例患者自然咳痰与诱导咳痰的Eos 比例结果不一致见表2。Eos 增高组和Eos 正常组的痰液细胞学分析结果见表3、4。

表2 4 例自然咳痰与诱导咳痰嗜酸粒细胞比例不一致的结果

3 讨 论

3.1 诱导痰细胞学检测的临床意义自1958年Bickerman 等[6]首次提出使用高渗盐水雾化吸入诱导痰液方法检测肺癌细胞，1992年Pin 等[7]将诱导痰液方法应用于哮喘患者的气道炎症检测以来，经过近二十多年来的发展，诱导痰细胞学检测方法被认为对呼吸道疾病的发病机制、诊断和治疗价值越来越高，尤其是在慢性咳嗽诊疗方面[1]。

3.2 两种方法对痰液颜色与性状的影响本研究结果发现自然咳痰与诱导咳痰法获得的痰液颜色变化有差别，而两种方法获得的痰液性状则无差别，且自然咳痰法的细胞总数较诱导咳痰法高。由于目前尚无这方面的研究报道可作参考，其可能原因是雾化吸入高渗盐水，气道内的痰液被高渗盐水稀释，痰液含水量增加，导致痰液颜色变浅、细胞总数减少。

表3 Eos 增高组的痰液细胞学分析结果比较

表4 Eos 正常组的痰液细胞学分析结果比较

3.3 两种方法对痰液细胞学分类计数结果的影响研究发现与自然痰相比诱导痰中单核细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸粒细胞总数增加，但百分比无差别，但该研究的痰液细胞分类计数结果采用痰栓直接涂片制片法在高倍镜下重复计数不同涂片至少4 个视野中400 个有核细胞[7]。然而，采用痰栓而不是经裂解处理的痰液，因痰液细胞存在趋化性特质，可影响人工细胞分类计数的结果。哮喘患者诱导痰的细胞活力较自然痰高，而总细胞计数两者相似[8]。慢性阻塞性肺疾病患者的诱导痰的细胞活力较自然痰高，而痰液总细胞计数及细胞分类计数两者相似[9]。慢性咳嗽患者诱导痰和自然痰中痰液细胞分类计数结果无差异[10]。本研究发现在全部入组患者以及Eos 增高组患者中，自然咳痰法的细胞存活率比诱导咳痰法低，两种方法的嗜酸粒细胞比例、淋巴细胞比例均无差别，组内相关系数检验提示两种咳痰方法对痰液细胞分类计数结果的一致性良好，与上述研究报道结果一致[8-10]。但本研究进一步发现，在全部入组患者以及Eos 正常组患者中，自然咳痰法的细胞总数、中性粒细胞比例均比诱导咳痰法高，而巨噬细胞比例则比诱导咳痰法低，与上述研究报道结果不同。推测可能的原因是研究对象不同，上述研究入选的分别为哮喘[8]、慢性阻塞性肺疾病、慢性支气管炎[10]等呼吸道疾病患者，而本研究入选的是胸部X 线检查正常的慢性咳嗽患者，此类患者大多临床表现为干性咳嗽，慢性咳嗽患者虽可自然咳痰，但痰量不多，经高渗盐水超声雾化诱导10 min 后咳出的痰量也不多，可能自然咳痰后再行雾化诱导咳痰，后者的痰液来源于相对较深部或较外周的气道，或是气道内的痰液被高渗盐水稀释。由此可见，本研究发现慢性咳嗽患者中自然咳痰与诱导咳痰法的痰液嗜酸粒细胞百分比是一个比较稳定的指标，而中性粒细胞和巨噬细胞百分比则不稳定。在临床工作中不能仅以自然咳痰或诱导咳痰法中的中性粒细胞百分比增高来判断患者气道存在细菌感染现象。由于诱导咳痰样本较自然咳痰样本的细胞存活率高，建议科学研究时，统一采用诱导咳痰的方法留取痰液样本。本研究60 例患者中亦有4 例患者的嗜酸粒细胞百分比前后不一致，提示在临床工作中，若出现痰液细胞分类结果与临床表现或治疗效果不一致时，不能仅以一次的痰液细胞学检测结果作为标准，应该结合临床表现、肺功能检查和影像学检查等其他的检查结果来综合判断，必要时应进行多次痰液细胞学检测。

综上所述，自然咳痰与诱导咳痰法均可用于痰液细胞学分析，两种方法对痰液嗜酸粒细胞比例评价无明显影响，但对中性粒细胞及巨噬细胞比例有影响。