龙骨对抗软骨细胞氧化损伤和坐骨神经损伤的研究

张靖宇

(郑州工业应用技术学院 医学院，郑州 451100)

龙骨，来源于古代哺乳类动物的骨骼化石，如马、牛类、 鹿类、象类等。龙骨属于矿物类中药, 主要分布在我国的西南部地区,全株入药。其主要功效有舒筋活络和祛风除湿，民间用于治疗风湿性关节炎、跌打损伤、胃痛病等[1]。骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是临床中常见的疾病，骨性关节炎的发病机制一直是研究的热点。研究发现，龙骨具有较强的促进骨伤愈合的功能[2]。本文对中药龙骨对骨关节炎软骨细胞的氧化损伤是否具有可逆作用，是否具有促进受损伤神经组织功能修复的作用进行研究，期望找到可能治疗骨关节炎的药物，为骨关节炎治疗提供药物奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物材料

健康 6 月龄新西兰大白兔30只，雌雄各半，空腹体重2.5kg左右。小鼠40只，雌雄各半，体重 20g左右。实验材料由上海生旺实验动物有限公司提供(SCXK-2008-0002)，实验过程中对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部颁发的 《关于善待实验动物的指导性意见》的要求。

1.1.2 药品与试剂

将中药龙骨过100目筛、煎煮2h, 制成龙骨水煎剂。

主要化学试剂：活性氧检测试剂盒、 NO检测试剂盒、IL- 1β、TNF α 放免试剂盒、低熔点琼脂、戊巴比妥钠等。其他为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 小鼠抗软骨细胞氧化损伤模型

将30只大白兔分为5组，分成对照组、模型组、添加龙骨水煎剂低剂量组、添加龙骨水煎剂中剂量组、添加龙骨水煎剂高剂量组，每组6只[3]。正常对照组由大白兔手术分离获得，10%IMDM 培养液培养；骨关节炎模型组分 4 组，由动物造模组获得，模型组 10%IMDM 正常培养。添加龙骨水煎剂低剂量组10 μg/mL龙骨水煎剂，添加龙骨水煎剂中剂量组20 μg/mL龙骨水煎剂，添加龙骨水煎剂高剂量组40 μg/mL龙骨水煎剂。

兔骨关节炎动物模型的建立采用改良Hulth法[4]。主要是切断内侧副韧带、前后交叉韧带、切除大白兔内侧半月板。将大白兔仰卧、四肢固定于手术台上，脱毛，消毒，取双后膝关节内侧横向切口，打开关节腔，切断内侧副韧带，探查关节腔无原发病变后，切断前交叉韧带，全部切除内侧半月板造模，逐层缝合切口。对照组操作同前，但不切断前交叉韧带和切除内侧半月板。一笼一兔喂养，喂养期间对大白兔进行训练，每天行走半小时。每周重复完成一组模型，共4周。第5周开始，每周处死一组动物，得到大白兔的软骨细胞，培养，测定数据，连续4周。

1.2.2 软骨细胞提取与培养

将大白兔固定后，处死，截取膝关节，浸入无菌液体。截取关节表面软骨，放入盛有D-Hank＇s无菌平皿中。后放入IMDM 培养液中，2000 r/min 离心 10min。收集离心后软骨，加入胰蛋白酶，37℃消化30 min。离心收集沉淀放入4 mL 0.2%胶原酶中。CO2培养箱培养 4 h。2000 r/min 离心 10min，收集沉淀，放入IMDM 培养液，接种于培养瓶中，置 CO2培养箱中培养[5]。

1.2.3 软骨细胞中活性氧(ROS)的测定

选择DCFH-DA 法检测细胞内活性氧水平。稀释 DCFH -DA达到1∶ 1 000倍，终浓度是10μm。细胞液放入DCFH-DA稀释液中。细胞浓度在15×106/mL。每隔一段时间摇晃一次。30min后用无血清培养液，除去DCFH-DA稀释液。流式细胞仪488nm光激发，525nm检测发射光强度，计数1万个细胞，检测细胞内平均荧光强度反应活性氧水平[6]。

1.2.4 NO、SOD 和 GSH-Px 含量的测定

将软骨细胞接种在24孔板中，每隔孔板0.5mL，重复6组。培养72小时后，细胞贴壁，用龙骨水煎液培养48h，收集上清液，5 000 r/min离心 10 min，取上清液冻存。

NO检测：采用Griess 法，以NaNO2为标准品，0，1，2，5，10，20，60 μm浓度不同绘制标准曲线，酶标仪检测样品，计算样品中亚硝酸盐的浓度，就是溶液中 NO浓度[7]。

SOD采用黄嘌呤氧化酶法。用可见分光光度计检测吸光度，当被测样品中含SOD 时,对超氧阴离子自由基有专一的抑制作用, 减少亚硝酸盐的形成,通过公式计算可求出被测样品中的SOD 活力[8]。

GSH-Px 含量采用DTNB法测定[9]。

1.2.5 抗坐骨神经损伤测定

实验分成2个小组，连续给小鼠用药4天。第5天麻醉小鼠，分离小鼠坐骨神经，形成坐骨神经损伤的动物模型。术后小鼠每天连续给灌服龙骨水煎剂, 持续2周。在术后第3周开始将小鼠放置在鼠笼上，记录小鼠爬网漏出鼠脚次数。每隔1周观察一次，每次5分钟[10]。

2 结果

2.1 软骨细胞中 ROS 测定

对照组ROS平均测定是6.67±0.12，模型组ROS平均测定是13.56±0.44。两组相比较P值<0．001，说明骨关节炎软骨细胞中存在氧化损伤情况。龙骨水煎剂低、中、高剂量组为10.54±0.31、9.14±0.72、7.89±0.91。模型组与龙骨水煎剂低、中、高剂量组相比较P值均<0．001，而且龙骨水煎剂低、中、高剂量组两两相比较显著性小于0.001和0.05。实验结果表明，加入剂量不同的龙骨水煎剂后，存在降低骨关节炎软骨细胞中活性氧水平的情况，并且随着龙骨水煎剂剂量的增加，骨关节炎抗氧化损伤作用增强，出现了一定剂量的依赖性情况。

2.2 软骨细胞中 NO、SOD 和 GSH-Px 测定

表1 龙骨水煎剂对软骨细胞培养上清中 NO、SOD 和 GSH-Px的影响Tab.1 The effect of the keel water decoction on the cultivation of chondrocytes on the NO, SOD and GSH-Px

表1显示，NaNO2检测结果模型组与龙骨水煎剂低剂量组、中剂量组和高剂量组相比，都是P<0.01，极显著。龙骨水煎剂三个组分两两比较，P>0.05，不显著。正常对照组相比较下，从骨关节炎软骨细胞培养情况看出，NO含量升高，说明骨关节炎软骨细胞上存在着氧化损伤情况。在龙骨水煎剂处理下骨关节炎软骨细胞中的NO存在下降情况，说明龙骨水煎剂能减轻细胞的氧化损伤。

表1显示SOD 检测结果，模型组与龙骨水煎剂低剂量组、中剂量组和高剂量组对比，P<0.05显著。龙骨水煎剂三个组分两两比较，P>0.05，不显著。GSH-Px 检测结果，模型组与龙骨水煎剂低剂量组相比，P>0.05，不显著。模型组与中剂量组和高剂量组相比，P<0.01，极显著。龙骨水煎剂三个组分两两比较，P<0.05，显著。正常对照组相比较下，骨关节炎软骨细胞培养情况看出，SOD、GSH-Px 含量明显降低，说明细胞的抗氧化能力减弱。随着龙骨水煎剂浓度的增加，SOD 和 GSH- Px 有升高趋势，说明细胞的抗氧化能力增强。龙骨水煎剂在一定范围内能提高软骨细胞的抗氧化能力。

2.3 抗坐骨神经损伤测定

表2 龙骨对小鼠坐骨神经损伤后步态恢复的影响Tab.2 The effect of keel on gait recovery after sciatic nerve injury in mice %

由表2看出，随着小鼠灌胃龙骨水煎剂后，小鼠漏脚率逐渐下降，且低于生理盐水。在连续灌服龙骨水煎液后，小鼠坐骨神经损伤后步态在第4、第5周时明显减少，说明龙骨水煎剂作用于小鼠坐骨神经后，具有促进受损伤神经组织功能修复的作用。

3 结语

本文对大白兔的骨关节软骨细胞进行NO 、SOD和GSH-Px 测定，确定含量的变化。对照组和模型组显示，软骨细胞中存在氧化损伤现象。加入龙骨水煎剂后，对骨关节炎软骨细胞的氧化损伤存在可逆现象，也就是说有逆转作用。随着龙骨水煎剂浓度的增加，氧化损伤逐渐减小，说明龙骨水煎剂能保护骨关节炎中的软骨细胞。在对小鼠抗坐骨神经损伤测定方面，在连续灌服龙骨水煎液后，小鼠坐骨神经损伤后步态明显减少，说明龙骨水煎剂作用于小鼠坐骨神经后，具有促进受损伤神经组织功能修复的作用。这一结果对治疗和修复骨关节炎有一定的作用，临床应用前景广阔。