6-苄氨基嘌呤预处理对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的干预效果及机制

邹 悦 李金容 唐兴江

(西南医科大学附属医院神经内科，四川省泸州市 646000，电子邮箱：573760533@qq.com)

脑卒中是全球第2大死亡原因[1]，具有高发病率和高致残率的特点。缺血性卒中是脑卒中常见的类型，是中枢神经系统最常见的脑血管疾病之一。目前，组织纤溶酶原激活剂是治疗缺血性卒中最有效的方法之一，但其治疗时间窗狭窄，禁忌证和并发症较多，因此临床上只有一小部分患者从中获益。研究表明缺血性脑卒中发病机制复杂，主要的机制有钙离子超载、炎症因子释放、氧化应激、线粒体自噬、细胞凋亡等。最近有学者提出，先天免疫诱导缺血后炎症反应，在脑缺血再灌注损伤中扮演重要角色，而NOD样受体热蛋白结构域3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3，NLRP3)是其中一个重要的潜在靶点。

6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是一种植物激素，也叫细胞分裂素，其在植物中的主要功能包括调控细胞周期、分化、分裂和衰老。动物实验结果显示，6-BA对小鼠卵巢、小肠、脑、肝脏等具有抗氧化应激、抗脂质过氧化的作用[2-5]。本研究探讨预处理6-BA对糖尿病大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑组织NLRP3和白细胞介素(interleukin,IL)-1β表达的影响，为进一步探究6-BA脑保护作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠100只，周龄6～7周，体重220～250 g，由西南医科大学城北动物实验中心提供，使用许可证：SYXK(川)2018-065，生产许可证：SCXK(川)2018-17。饲养于清洁动物房，用普通饲料喂养，饮用自来水，自然光照，室温22℃～25℃。

1.2 试剂和仪器 6-BA购自合肥博美生物科技有限责任公司(批号：2016122011；100 mg/瓶)，用0.06 mol/L盐酸配制成1 000 mg/L、2 000 mg/L的6-BA储备液备用。兔抗大鼠NLRP3多克隆抗体(英国Abcam公司，批号：ab214185)，兔抗大鼠IL-1β多克隆抗体(英国Abcam公司，批号：ab16502)，链脲佐菌素(美国Sigma公司，批号：20170508c5)，脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒(美国Roche公司，批号：11684817910)，二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)显色剂(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLL-9033)。微量血糖仪(长沙三诺生物传感股份有限公司，型号：2015709723)，光学显微镜(日本Olympus公司，型号：CX-21)，荧光显微镜(日本Olympus公司，型号：IX51)。

1.3 动物模型制备及预处理

1.3.1 糖尿病大鼠模型的建立：参考林心君等[6]的方法制作糖尿病大鼠模型。采用高脂高糖饲料喂养大鼠4周，4周后用腹腔注射低剂量的链脲佐菌素2次，25 mg(kg·m2)，间隔2 d，第5周采用微量血糖仪测大鼠随机血糖，随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病大鼠模型造模成功。

1.3.2 动物分组：采用随机数字表法将糖尿病大鼠分为4组，包括假手术组、对照组、低剂量6-BA组、高剂量6-BA组，每组25只。

1.3.3 药物干预：成功建立糖尿病大鼠模型后，在建立大脑中动脉阻断模型前7 d，低剂量6-BA组、高剂量6-BA组大鼠分别给予20 mg/kg、40 mg/kg的6-BA灌胃，假手术组和对照组大鼠用等量的0.06 mol/L盐酸灌胃,1次/d,连续给药7 d。

1.3.4 缺血再灌注损伤模型的建立：采用改良Longa法[7]建立大脑中动脉阻断缺血再灌注损伤模型。用10%水合氯醛(0.3 mg/kg)腹腔麻醉大鼠后，将大鼠仰卧固定，取颈部正中切口，分离并暴露右侧颈总动脉及颈内、外动脉，结扎颈总动脉及颈外动脉根部。在低剂量6-BA组、高剂量6-BA组、对照组大鼠的颈总动脉近分叉部5 mm处，剪一“V”形小口，插入鱼线(长50 mm，直径0.26 mm，于18 mm处做标记)，感到有轻微阻力时即停止插入，插入深度为(18.0±0.5)mm，结扎并固定插线，缝合皮肤，阻断血流2 h后，拔出鱼线进行再灌注。假手术组只需要暴露出颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，不结扎、不插入鱼线，其余步骤与其他3组一致。实验过程如有大鼠死亡，按相同条件给予补充。

1.4 观察指标 分别于再灌注后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，每组各取5只大鼠进行神经功能缺损评分，然后处死大鼠取脑组织检测NLRP3、IL-1β的表达情况，计数大鼠脑组织海马CA1区梗死灶细胞凋亡数。

1.4.1 神经功能缺损评分：采用Garcia评分[8]对大鼠自主运动、体态对称性、前肢伸展功能、网屏实验、身体双侧触觉、双侧胡须反射情况进行评分，总分3～18分，得分越高说明神经功能损伤越轻。

1.4.2 脑组织NLRP3、IL-1β的表达：采用免疫组化法测定大鼠脑组织NLRP3、IL-1β的表达情况，严格按照试剂盒说明书进行操作。在高倍镜下计数每张切片梗死灶NLRP3、IL-1β阳性细胞数，阳性细胞为胞核呈棕黄色的细胞，共观察5个视野，取均值。

1.4.3 细胞凋亡检测：采用TUNEL染色法检测海马CA1区梗死灶细胞凋亡情况，严格按照试剂盒说明书进行操作。荧光显微镜下凋亡细胞的胞核为绿色荧光，高倍镜下计数每张切片海马CA1区梗死灶5个视野的阳性细胞数，取均值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 4组大鼠Garcia评分比较 在各时间点，假手术组、高剂量6-BA组、低剂量6-BA组、对照组的Garcia评分均依次降低(均P<0.05)，见表1。

表1 不同时间点4组大鼠Garcia评分比较(x±s，分)

注：各时间点，与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05；与低剂量6-BA组比较，△P<0.05。

2.2 4组大鼠脑组织NLRP3及IL-1β的表达水平比较 在各时间点，假手术组、高剂量6-BA组、低剂量6-BA组、对照组的NLRP3及IL-1β阳性细胞数均依次升高(均P<0.05)，见表2～3。

表2 4组大鼠脑组织NLRP3阳性细胞数比较(x±s，个/视野)

注：各时间点，与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05；与低剂量6-BA组比较，△P<0.05。

表3 4组大鼠脑组织IL-1β阳性细胞数比较(x±s，个/视野)

注：各时间点，与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05；与低剂量6-BA组比较，△P<0.05。

2.3 4组大鼠海马CA1区凋亡细胞数比较 在各时间点，假手术组、高剂量6-BA组、低剂量6-BA组、对照组的海马CA1区凋亡细胞数均依次增加(均P<0.05)，见表4。

表4 大鼠海马CA1区凋亡细胞计数(x±s，个/视野)

注：各时间点，与假手术组比较，*P<0.05；与对照组比较，#P<0.05,与低剂量6-BA组比较；△P<0.05。

3 讨 论

近年来，随着人们生活方式的改变，以及生活质量的提高，糖尿病患病率也逐渐增加，而糖尿病是缺血性脑卒中发病的独立危险因素，糖尿病患者并发脑梗死的危险性是未患糖尿病者的2～5倍[9]。有研究证实，糖尿病对脑血管疾病的损伤机制包括以下几个方面：(1)高血糖加重血管内皮细胞的损伤[10]，促进血管基质蛋白的非酶氧化反应，使得脂质代谢受到一定程度的影响，加速动脉粥样硬化的发生和发展[11-13]；(2)高糖可激发体内氧化应激状态，刺激活性氧的产生[14]，明显增加脑血管疾病的患病风险。6-BA具有稳定、安全、廉价和易于使用的优点，不仅具有抗氧化应激、抗脂质过氧化的作用，可能还有抗炎、抗凋亡等作用。张自强等[4]发现，6-BA对小鼠脑组织氧化损伤具有一定的保护作用。而在高糖合并脑组织损伤的状态下，6-BA是否可以发挥脑组织保护作用，鲜见有相关研究。因此，本研究观察6-BA预处理对糖尿病大鼠脑缺血再灌注损伤后缺血区NLRP3、IL-1β表达的影响，为进一步探讨其在脑缺血再灌注损伤中的脑保护作用具有一定的现实意义。

炎症反应是脑缺血再灌注损伤的机制之一，在脑缺血再灌注早期，机体会释放出大量的炎症因子，如IL-1、IL-6、肿瘤坏死因子α、C反应蛋白等，可进一步加重脑组织的损伤。抑制炎症因子释放和上调抗炎因子的表达，是治疗脑缺血再灌注损伤的方法之一。IL-1β是参与炎症反应的主要促炎因子，主要来源于活化的小胶质细胞，在协调有效的先天性和适应性免疫中扮演重要角色，可激活吞噬细胞、上皮细胞、内皮细胞等进一步促进炎症细胞因子的表达，从而加重局部炎症反应[15-16]。

NLRP3属于胞质内模式识别受体，激活后可形成NLRP3炎性体，在脑组织损伤过程中，NLRP3炎性体可促进IL-1β的产生，加重炎症反应，不利于损伤脑组织的修复[17-18]。有研究表明，多种外源性及内源性因素，如感染、组织损伤、代谢失调、胞外三磷酸腺苷、乙酰透明质酸、Aβ原纤维、尿酸晶体等，均可激活NLRP3形成NLRP3炎性体[19]。还有研究显示，活性氧、细胞内钾离子外流和溶酶体破裂释放组织蛋白B可能是NLRP3被激活形成NLRP3炎性体的主要模式[20]。而脑缺血再灌注后，大量活性氧的产生可诱导氧化应激，促进钙离子释放，钾离子外流增多，三磷酸腺苷生成减少，NLRP3被激活形成NLRP3炎性体，炎症反应级联放大。抑制NLRP3的表达，减少NLRP3炎性体的形成，从而减轻炎症反应，是减轻脑缺血再灌注后脑组织损伤的途径之一。

本研究结果显示，在各时间点，假手术组、高剂量6-BA组、低剂量6-BA组、对照组的Garcia评分依次降低，而NLRP3及IL-1β阳性细胞数依次升高(均P<0.05)，提示6-BA可能通过抑制NLRP3的表达从而下调IL-1β的表达，减轻炎症反应，起到保护脑神经元细胞的作用。其机制可能是6-BA可以清除氧自由基，从而抑制NLRP3被激活形成NLRP3炎性体，减少炎性细胞因子、黏附分子的产生，减轻脑组织水肿及神经功能损伤。有学者指出，NLRP3可以增加胱天蛋白酶1的作用从而导致细胞凋亡，而胱天蛋白酶-1也可以促使参与糖酵解过程中的一些酶失去活性，导致细胞失去生物活性后死亡[21]。本研究结果还显示，在各时间点，假手术组、高剂量6-BA组、低剂量6-BA组、对照组的海马CA1区凋亡细胞数依次增加(均P<0.05)，提示6-BA可能通过抑制NLRP3表达，下调胱天蛋白酶-1、IL-1β的表达，从而减轻脑梗死后水肿周围组织神经细胞的凋亡，起到脑保护作用。

综上所述，6-BA预处理可减轻脑缺血再灌注后糖尿病大鼠的炎症反应，促进大鼠的神经功能恢复，6-BA可能通过下调NLRP3的表达从而减少IL-1β生成及神经细胞凋亡，减轻炎症反应，起到脑保护作用。