茶酒发酵动力学研究

王荣荣，姜兴旭，陈龙，朱静

（信阳农林学院食品学院，河南 信阳 464000）

茶，被历朝历代的养生家、药学家称为“万病之药”，其药用价值的历史也十分悠久，是被世人公认的、天然的功能性饮料。从古至今，我国人民就有喝茶的良好习惯。绿茶，是未经发酵而直接制成的茶，其香气纯净、口感柔和，含有500 多种有机化合物和26 种以上无机矿物质，还含有茶多酚、茶多糖和咖啡碱等功能成分和人体必需的蛋白质、氨基酸和维生素等，具有抗衰老、防癌、抗菌、抗辐射、消炎等特殊生理作用[1-2]。

茶酒是以茶叶和蔗糖为原料，经酿酒酵母发酵、过滤、澄清、陈酿而制成的酒精饮料。茶酒中含有丰富的氨基酸、维生素及茶多酚、咖啡碱等多种营养成分，日常适量饮用，可起到健胃生津、醒脑明目、改善代谢紊乱、增强机体免疫力等功效[3-8]。

对茶酒的研制与我国酒类研发的保健方向一致，既增加了市场上的酒类品种，又具有十分广阔的发展前景。目前，李国胜等[9]、周丹丹等[10]、刘锐等[11]对茶酒发酵工艺进行了优化，但并未进行动力学研究；李秀萍等[12]、靳梦楚等[13]、李雪等[14]、熊亚等[15]对甘蔗、火龙果、仙人掌果酒发酵动力学模型进行了研究，但都仅限于菌体生长、产物生成和底物消耗，研究均为酵母在果酒中的动力学。茶酒发酵动力学主要是采用数学模型来定量描述在发酵过程中的菌体浓度、底物浓度和产物浓度随时间变化的规律，对于研究发酵工艺参数、优化和控制过程操作具有十分重要的意义[16]。在目前的研究中，对于茶酒动力学尚未有相关文献报道，本研究以信阳毛尖和蔗糖为原料，酿酒酵母为发酵菌株，对茶酒发酵过程中主要理化指标测定，进行茶酒发酵规律的研究，并构建其动力学模型，从而为优质茶酒的开发和研制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

信阳毛尖、一级蔗糖：沃尔玛超市；果酒专用酵母：安琪酵母股份有限公司；酒石酸钾钠、氢氧化钠、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠：天津市巴斯夫化工有限公司。

1.1.2 仪器与设备

电子天平（FA2104）：上海良平仪器仪表有限公司；酒精计（0～100）：河北省武强县同辉仪表厂；生化培养箱（SPX-250BIII）：北京科伟永兴仪器公司；双光束紫外可见分光光度计（TU1901）：北京普析通用仪器有限责任公司；pH 计（STARTER3C）：奥豪斯仪器（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

茶酒的制作工艺参考李建芳等[17]，略作调整。

茶叶与水按 1 ∶50（g/mL）在 90 ℃～95 ℃浸提 30 min，过滤，冷藏备用。糖度调整为17°Bx，pH 4.5，酵母接种量0.3%，活化后接种至茶汤中，24 ℃恒温发酵13 d，每隔48 h 取样检测。

1.2.2 检测方法

每隔1 d 测一次指标，每次都在固定时间取样，按照相应的检测方法检测不同时期各个理化指标数值。以发酵时间为横坐标，对应的理化指标为纵坐标，绘制出各理化指标随时间的变化曲线。

1.2.2.1 酒精度的测定

参照GB/T15038－2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》酒精计法。

1.2.2.2 总酸的测定

参照GB/T15038－2006 直接滴定法。

1.2.2.3 总糖的测定

参照GB/T15038－2006 直接滴定法。

1.2.2.4 酵母量的测定

采用干重法[18]：每次取酒液 20 mL，4 000 r/min，离心15 min，弃上清液，然后在恒温干燥箱中干燥至恒重后称重。

1.2.2.5 茶多酚的测定

依据《市场茶饮料中茶多酚含量的测定与分析》中的酒石酸亚铁法[19]。

1.2.2.6 氨基酸的测定

采用甲醛中和滴定法[20]。

1.3 茶酒发酵动力学模型的建立及差异显著性分析

试验中做3 组平行试验，取其平均值。菌体生长、产物生成、底物消耗的动力学模型的建立采用MATLAB 数据分析软件进行分析，采用DPS 数据处理系统进行差异显著性分析。

1.3.1 酵母菌生长动力学模型

Logistic 模型是一个非常典型的S 形曲线方程[21]，同时也是一个广泛应用于拟合酿酒酵母生长的曲线模型，因而适合茶酒中菌体生长动力学的研究。李雪等[14]在仙人掌果酒发酵动力学研究中，用此模型拟合酵母菌生长。方程如下：

上式两边积分得：

式中：X 为菌体量，g；μm为最大比生长速率，h-1；Xm为最大菌体量，g；X0为初始菌体量，g；t 为发酵时间，h。

1.3.2 酒精度生成动力学模型

茶酒发酵过程中，酵母菌利用酒液中的糖类来发酵产生酒精，酒精生成与酵母菌的生长属于生长“偶联型”，也就是说随着酵母菌的生长而不断发酵产生酒精，二者之间的变化应该是一致的。在茶酒发酵初期，酵母菌因需要适应生长环境而生长速度较慢，在该阶段中酒精度的增加也是缓慢的；而随着酵母菌适应生长环境以后，进入指数生长期时，该阶段的酒精含量也随之呈指数上升；当酵母菌的数量繁殖到一定程度时，体系中的基质糖分含量减少，菌体会呈现稳定生长时，说明该体系酒精度也比较恒定，达到发酵末期。因此，选用Luedeking-Piret[22-23]模型来拟合乙醇生成动力学模型，即：

因 a≠0，b=0，模型可简化为：

上式两边积分得：

式中：a 为生长偶联参数；t 为发酵时间，h；P 为产物酒精度，%vol。

1.3.3 底物消耗动力学模型

糖类物质在茶酒发酵过程中，主要是作为碳源，用来提供酵母菌生长繁殖所需要的能量。随着酵母菌的生长呈现“S”型，体系内的糖类被酵母菌不断地消耗，残糖量也不断下降。本研究将DoseResp 模型应用到茶酒发酵动力学模型上，来对发酵过程中残糖量进行拟合。方程式为：

上式两边积分得：

式中：S（0）为初始糖浓度，g/L；t 为发酵时间，h；M0为菌体细胞维持相关常数；X 为菌体量，g；P 为产物酒精度，%vol；Yx/s为最大细胞得率系数；Yp/s为产物得率系数。

2 结果与讨论

2.1 茶酒发酵过程中总糖的变化

茶酒发酵过程中总糖的变化如图1。

从图1可以知道，在发酵初期，由于酵母菌大量生长繁殖的需要，对糖的利用率很高，导致降糖速度非常快。随着发酵的进行，降糖速度变慢，主要是由于酒精含量和酸度的不断增加，均会在一定程度上影响酿酒酵母的代谢活动能力，从而降低了糖的消耗速度。直到总糖不再变化时，发酵也几乎停止，到主发酵结束时总糖含量为7.5 g/L。

图1 发酵过程中总糖的变化Fig.1 Changes of total sugar consumption during fermentation process

2.2 茶酒发酵过程中酒精度的变化

酒精是茶酒的主要成分，它的含量高低，对酒的风味和品质有重要影响。茶酒发酵过程中酒精度含量的变化见图2所示。

图2 发酵过程中酒精度的变化Fig.2 Changes of alcohol accuracy during fermentation process

根据图2可以看出，发酵前7 d 时酒精含量增加速度很快，第7 天后酒精含量增加缓慢，可能是因为茶酒中的酒精、茶多酚、咖啡碱在一定程度上对酵母的代谢有抑制作用。酒精度的变化与酵母菌的生长曲线相对应，说明二者呈“偶联”状态。在发酵后期酒精度几乎不再增加，表明酵母进入衰亡期，发酵基本停止，酒精度为8.5%vol。

2.3 茶酒发酵过程中总酸的变化

总酸是茶酒发酵过程中的一个重要理化指标，它直接影响茶酒的风味，口感和品质。发酵液酸度变化主要来自酵母在生长、繁殖、代谢活动中产酸，随着酸度的增加也有利于增强茶酒的抑菌作用，避免杂菌污染。茶酒发酵过程中总酸含量的变化见图3。

图3 发酵过程中总酸的变化Fig.3 Changes of total acid during fermentation process

由图3可知，发酵前5 d 酸度升高，原因是在发酵前期酵母菌代谢产生有机酸，第5 天之后，酸度有浮动，原因是酒液中的有机酸可以被酵母利用[24]。

2.4 茶酒发酵过程中酵母量的变化

茶酒发酵过程中酵母菌数量的变化直接关系到茶酒的品质。茶酒发酵过程中酵母量含量的变化如图4所示。

图4 发酵过程中酵母量的变化Fig.4 Changes of the amount of yeast during the fermentation process

由图4可知，在发酵前2 d 里酵母菌生长速度较为缓慢，随后进入对数生长期后开始进行大量繁殖。第9 天后酿酒酵母细胞数量增加变缓，接近发酵结束时，酵母菌受到酒精和生长条件恶化的影响开始出现下降趋势。

2.5 茶酒发酵过程中茶多酚的变化

茶多酚是茶酒中的重要功能成分之一，具有抗氧化、抗辐射、解毒等作用[25]。茶酒发酵过程中茶多酚含量的变化见图5。

从图5可以看出，随着发酵过程的进行，茶酒里茶多酚的浓度在不断下降，原因可能是酶促反应和氧化反应的影响[26]，茶多酚在光照、有氧的条件下会发生氧化聚合反应，形成茶色素类物质；尤其在发酵初期，茶酒中的氧气含量较高，茶多酚的降低幅度较大[27-28]。随着茶酒中总酸的增多，使得酶促反应和氧化作用减弱，因此在发酵后期茶酒中茶多酚的含量趋于稳定，发酵结束时茶多酚的浓度为2 902.35 mg/L。

图5 发酵过程中茶多酚的变化Fig.5 Changes of tea polyphenols in fermentation process

2.6 茶酒发酵过程中氨基酸的变化

氨基酸也是茶酒中的重要功能成分之一，其具有鲜味，跟茶酒的香气、品质和滋味有着非常重要的关系。茶酒发酵过程中氨基酸含量的变化见图6。

图6 发酵过程中氨基酸的变化Fig.6 Changes of amino acids during fermentation process

从图6可以看出，在发酵前期游离氨基酸的含量先是迅速上升，随后又开始下降，在发酵中期游离氨基酸的含量逐渐下降，最后趋于稳定。在发酵末期茶酒中游离氨基酸的含量为0.002 49 mg/100 mL。

2.7 茶酒发酵动力学研究

茶酒发酵动力学模型主要是研究发酵过程中菌体生长、产物生成和底物消耗的关系，以及这几个指标与发酵时间的联系。本试验采用MATLAB 对茶酒发酵过程主要理化指标的试验数据进行非线性拟合，建立动力学方程，并采用DPS 数据处理系统进行差异显著性分析，来探究茶酒发酵规律，为优质茶酒的开发和研制提供理论基础。

2.7.1 菌体生长动力学模型

采用Logistic 经典模型对茶酒发酵过程中酵母菌的数目进行拟合，得到图7所示拟合曲线，方差分析结果如表1所示。

模型的预测值和实测值的平均拟合误差为2.32%，模型的 F 值为 390.031，P 值≤0.01，呈现极显著，表明拟合效果好，说明该模型能较好地描述茶酒发酵过程酵母菌数的动态增长过程。拟合求解得X0=0.086；μm=0.358，Xm=0.235；并带入方程得到酵母生长动力学模型方程为：

图7 茶酒发酵过程中酵母菌生长拟合曲线Fig.7 The growth fitting curve of yeast in the process of fermentation

表1 茶酒酵母菌体生长动力学模型方差分析表Table 1 Analysis of variance of fermentation kinetic model of yeast

2.7.2 酒精度生成动力学模型

茶酒发酵过程中酒精生成量实际值与拟合曲线如图8所示，方差分析结果如表2所示。与图7对比可知，酒精的生成与酵母菌的生长基本同步。模型的预测值和实测值的平均误差为3.82%，模型的F 值为1 439.068，P 值≤0.01，呈现极显著，表示拟合效果良好，说明该模型能够较好地描述茶酒发酵过程酒精的动态增长过程。根据不同时间的酒精含量试验数据（P），将公式（8）和 X0带入公式（5），运用软件进行拟合，经运算得到a=59.438。将运算得到的参数值带入公式（5），得到茶酒发酵过程中产物生成动力学模型为：

图8 茶酒发酵过程中酒精生成拟合曲线Fig.8 The fitting curve of alcohol content in the process of fermentation

表2 茶酒酒精生成动力学模型方差分析表Table 2 Analysis of variance of fermentation kinetic model of alcohol content

2.7.3 底物消耗动力学模型

底物消耗动力学方程拟合采用DoseResp 模型进行，得到的拟合曲线如图9所示，方差分析结果如表3所示。

图9 茶酒发酵过程中底物消耗拟合曲线Fig.9 The fitting curve of Substrate consumption in the process of fermentation

表3 茶酒底物消耗动力学模型方差分析表Table 3 Analysis of variance of fermentation kinetic model of substrate consumption

模型的预测值和实测值的平均拟合误差为5.53%，模型的F 值为3 182.341，P 值≤0.01，呈现极显著，说明拟合效果较好，表明该模型能够较好地反映茶酒发酵过程中底物消耗的动态变化。拟合求解得1/Yx/s=161.93，1/Yp/s=12.54，M0=11.498；将式（5）带入式（7），求解参数一并带入方程得到底物消耗动力学模型方程为：

3 结论

本试验采用Logistic 方程、Luedeking-Piret 方程与DoseResp 方程，利用MATLAB 对茶酒发酵过程中的菌体数目、酒精生成和糖消耗量分别进行方程拟合，采用DPS 数据处理系统进行差异显著性分析，拟合平均误差分别为2.32%、3.82%、5.53%，模型的F 值分别为 390.031、1 439.068、3 182.341，P 值均≤0.01，说明拟合效果良好，表明所选的方程可以较好地反映茶酒的发酵过程的动态变化。同时，本次试验在进行动力学研究的基础之上，测定了多种指标的变化，如茶多酚和氨基酸等。发酵结束时，茶酒中总糖含量为7.5 g/L，酒精度为8.5 %vol，游离氨基酸的含量为0.002 49 mg/100 mL，茶多酚的浓度为2 902.35 mg/L。在茶酒发酵过程中，总糖和茶多酚的变化趋势也与之前的文献报道一致[29]，进一步验证了茶酒发酵过程物质变化的规律。

综上，茶酒发酵过程中主要理化指标的变化呈现一定规律，这也与文献报道[24]有所符合，从而为优质茶酒的研究和开发提供理论基础。茶酒发酵过程的机理较为复杂，本次仅研究分析了几种重要的理化指标，对茶酒的生产研发有一定的指导意义，但要想生产出质量上乘的茶酒则需要进行更深入的研究。