不同强度运动对老年脂肪肝大鼠脂代谢异常及氧化应激的影响

阮凌

(安康学院体育学院，陕西 安康 725000)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)发病过程包括从简单脂肪变性脂肪肝与肝细胞损伤，发展到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，最后出现肝脏的纤维化和肝硬化〔1〕。Keating等〔2〕研究运动强度和运动量对降低动物NAFLD模型中肝脏和内脏脂肪组织脂肪含量，发现运动量和运动强度的变化对于减少肝脏脂肪和内脏脂肪无显著差异。而Zhang等〔3〕和 Tsunoda等〔4〕研究发现大强度和中等强度运动均有减少肝脏内三酰甘油(TG)的含量的作用，但大强度运动对于降低体重，体脂，腰围和血压较中等强度效果好。同样，Tsunoda等〔4〕也报道大强度运动有阻止NAFLD发展为NASH的作用，其效果较小强度和中等强度更加。两篇研究显示参与有氧运动的NAFLD患者，肝脏内脂肪明显减少，但最佳运动强度尚未确定〔2，5〕。大量的研究显示不同类型的运动对NAFLD的作用〔6〕，总的来说，这些研究建议运动强度相对运动量和运动时间而言，对于运动保护NAFLD起到了更为重要的作用。

有研究显示耐力运动可以降低久坐的NAFLD人群肝细胞凋亡的标志物，肝细胞凋亡数量的减少可能与脂代谢能力有关〔7〕。Gonçalves等〔8〕研究显示高脂饮食诱导的NAFLD大鼠线粒体驱动肝细胞凋亡信号传导，而耐力性运动可以减少线粒体细胞色素C的释放，减少细胞膜电位的消耗。本研究旨在探讨不同强度运动训练对NAFLD大鼠脂代谢异常、氧化应激、肝细胞损伤的影响。

1 对象与方法

1.1研究对象及分组 将购于广州医学院动物中心的50只SD雄性大鼠随机分为普通安静对照(CON)组和高脂饮食诱导模型(HFD)组；小强度运动(LIE)组、中等强度运动(MIE)组和递增强度运动(IIE)组，共计5组，每组10只。

1.2高脂饮食诱导NAFLD大鼠模型的建立 采用高脂饲料(在基础饲料基础上添加5%蔗糖、18%猪油、15%蛋黄粉、0.5%胆酸钠和1%胆固醇)喂养大鼠。喂养16 w后，处死大鼠取肝组织制作苏木精-伊红(HE)切片，测试各项生理生化指标，并参考NAFLD病理诊断标准对本模型三酰甘油(TG)，总胆固醇(TC)，低密度蛋白胆固醇(LDL-C)，高密度蛋白胆固醇(HDL-C)，游离脂肪酸(FFA)及肝功能酶进行评估；同时制作肝组织病理HE切片，并送两位职业病理医师通过盲法诊断是否符合临床NAFLD患者诊断标准，建立NAFLD大鼠模型〔9〕。

1.3运动方案 运动负荷的设定是根据大鼠的健康情况，参考Bedford经典跑台实验模型来设计。运动组大鼠在适应性跑台训练1 w后进行相应强度运动，LIE组：速度15 m/min，60 min/(次·d)；MIE组：速度20 m/min，60 min/(次·d)；IIE组：速度15 m/min(10 min)、速度20 m/min(30 min)，速度27 m/min(20 min)。运动组均5 d/w，共6 w。

1.4血液指标测试 通过全自动生化分析仪检测血液中的TG、TC、HDL-C、LDL-C和FFA含量。

1.5肝组织病理学切片 取部分肝脏用生理盐水漂洗数次后，将肝组织置于10%中性甲醛溶液固定24～48 h，用于制备肝组织病理学切片。鉴于脂肪肝的病理切片在脱蜡过程中肝细胞中的脂肪沉积会被洗脱，故在光镜下呈空泡状，可用于鉴定NAFLD病理形态学特性。

1.6肝脏组织免疫组织化学 将大鼠肝脏石蜡切片，TUNEL法测试肝细胞凋亡，用免疫组织化学法测试阳性细胞表达。淋巴细胞瘤-2基因 (Bcl-2)和Bal-2相关x蛋白(Bax)指标，严格按照试剂盒说明进行规范操作。采用JVC3-CCD摄像头和Image-Pro Plus图像处理软件进行图像采集与分析。每只大鼠肝组织连续切片，每隔5张选取一张，共取8张切片，每张片随机选取6个视野，在400倍光镜下对5组大鼠肝脏内的凋亡肝细胞、Bcl-2和Bax 的阳性表达计数。SP定量分析结果以单个视野下阳性细胞光密度值表示。

1.7数据分析 采用SPSS16.0软件进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1不同强度运动对大鼠体重和肝重的影响 HFD组体重较CON组显著增加(P<0.05)，与HFD组相比，MIE组体重显著降低(P<0.05) ；但各组肝重差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 不同强度运动对大鼠体重和肝重的影响

与 CON 组相比：1)P<0.05；与HFD组相比：2)P<0.05

2.2不同强度运动对脂代谢和肝损伤的影响 肝组织进行HE切片显示CON组肝组织呈现出良好的排列，肝细胞有圆形的中心核，肝小叶沿中心静脉的轮状阵列细胞排列。而HFD组肝组织可见脂滴的分布。通过不同强度运动后，肝细胞内脂滴的数量和体积都减少。HE切片显示，高脂饮食大鼠出现肝组织脂代谢紊乱，而不同强度运动可改善脂代谢异常(见图1)。

血脂指标：HFD组较CON组 TG，TC，LDL-C和FFA显著升高(P<0.01)。运动组与HFD组相比TG、TC、LDL-C和FFA水平显著降低(P<0.05,P<0.01)。肝功能酶：与CON组相比，HFD组谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)显著升高(P<0.01)。与HFD组相比，各运动组ALT和AST显著下降(P<0.01)。见表2。

图1 各组大鼠肝组织HE切片(×400)

组别TG(mmol/L)TC(mmol/L)LDL-C(mmol/L)HDL-C(mmol/L)FFA(μmol/L)ALT(U/L)AST(U/L)CON组0.45±0.131.36±0.330.26±0.060.41±0.01313.13±23.1551.12±2.2295.68±10.15HFD组1.55±0.211)5.09±0.241)1.89±0.131)0.32±0.07627.33±97.781)247.66±35.261)201.33±21.151)LIE组0.87±0.303)4.17±0.202)1.13±0.112)0.35±0.11569.2±39.393)123.65±69.383)89.71±24.163)MIE组0.80±0.203)4.06±0.102)1.05±0.162)0.37±0.08558.24±68.243)113.85±47.663)91.52±26.383)IIE组0.79±0.183)4.12±0.162)1.05±0.162)0.37±0.09567.65±49.723)106.37±47.663)88.61±35.293)

与CON组相比：1)P<0.01；与 HFD组相比;2)P<0.05，3)P< 0.01

2.3不同强度运动对NAFLD大鼠肝脏氧化指标的影响 与CON组相比，HFD组肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平显著下降(P<0.01)，丙二醛(MDA)水平显著升高(P<0.05)。与HFD组相比，各运动组SOD水平均显著升高(P<0.01)，与IIE组相比，LIE组和MIE组SOD活性显著升高(P<0.01)；与HFD组比较，各运动组MDA水平均显著降低(P<0.01) ；与HFD组相比，MIE组过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)水平显著升高(P<0.05，P<0.01)；与HFD组相比，LIE组、MIE组和IIE组GSH水平均显著升高(P<0.05，P<0.01，P<0.05)，与IIE组相比，MIE组GSH显著升高(P<0.05)，见表3。

组别SOD(U/mg·prot)MDA(nmol/mg·prot)CAT(U/mg·prot)T-AOC(U/mg·prot)GSH(μmol/mg·prot)CON组179.42 ±34.988.43±3.7713.05±5.525.75±1.55818.35±261.62HFD组37.32±13.862)14.18±3.131)9.72±2.993.62±1.85384.32±80.452)LIE组358.38±191.842)4)6)5.97±2.834)28.26±3.237.01±2.07734.91±344.903)MIE组371.47±151.672)4)6)4.36±1.594)29.61±8.873)10.51±3.164)865.11±205.504)5)IIE组317.28±173.212)4)4.91±2.894)23.81±14.546.05±2.48539.70±282.263)

与CON组相比：1)P< 0.05，2)P<0.01；与HFD组相比：3)P<0.05，4)P<0.01；与IIE组相比：5)P<0.05，6)P<0.01，下表同

2.4不同强度运动对TUNEL法测试凋亡肝细胞及Bax和 Bcl-2的阳性表达的影响 与CON组相比，HFD组TUNEL法测试肝细胞凋亡数量阳性表达显著增加(P<0.05)，与HFD组相比，LIE、MIE和IIE组肝细胞凋亡均显著减少(P<0.05)。 运动6 w后，与CON组相比，HFD组Bcl-2显著降低(P<0.01)，同时Bax蛋白表达显著增加 (P<0.01)；与HFD组相比，LIE和MIE组Bax蛋白表达均显著降低 (P<0.01)，LIE 组和MIE组Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.05，P<0.01)，见图2、图3、表4。

图2 TUNEL法测定凋亡肝细胞的阳性表达(×400)

图3 免疫组化法测试 Bax和 Bcl-2蛋白表达(×400)

表4 TUNEL法测试凋亡肝细胞及Bax和 Bcl-2的阳性表达

3 讨 论

NAFLD发展的病理机制主要与脂代谢紊乱、炎症反应、氧化应激和肝细胞凋亡密切相关〔10，11〕。 运动是美国肝病研究协会〔12〕推荐治疗NAFLD的主要方式，尽管运动强度和其机制尚未确定〔2，5〕。

Matthew Morris等〔13〕研究中采用高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型，通过高脂饮食喂养16 w大鼠，出现血脂异常，高血糖，肝脏损伤标志物表达升高及脂代谢紊乱导致的肝脏组织学变化等一系列症状。由于正常肝细胞不能分解过量的FFA，特别是长链饱和脂肪酸，过量的长链脂肪酸转化为TG，从而诱导的肝细胞内细胞器发生氧化应激，特别是线粒体和内质网，最终激活了肝细胞凋亡的途径〔14，15〕。通过大量的研究表明氧化应激，脂质过氧化和肝细胞损伤在NAFLD的发病机制中起着重要作用，特别是在高脂饮食诱导的NAFLD大鼠模型中。

Fisher等〔16〕研究还未发现HDL-C的改善，但是通过6 w不同强度的训练我们可以看到TC，TG，LDL-C和FFA浓度降低，表明不同强度的运动均可降血脂，防止肝脏进一步损伤。目前有研究表明〔8〕，中等强度运动对脂代谢紊乱有一定改善效果，但很少有不同强度的运动之间的对比研究。最近的一些研究表明，高强度间歇训练和持续的适度训练对NAFLD的影响，结果显示这两种训练对降低NAFLD大鼠的FFA、TG、ALT和AST有同样的效果〔6，16，17〕。另外还有研究显示：中、小强度运动和大强度运动对改善TC，TG，ALT和AST具有相同的作用〔18〕。本研究结果也提示，不同运动强度对降低血脂，改善肝功能酶和防止肝损伤方面同样有效。

氧化应激与脂质过氧化已被证明会损害肝脏中的核苷酸和蛋白质合成，从而导致NAFLD大鼠肝细胞凋亡，肝组织炎症和纤维化。运动提高机体抗氧化能力，对改善NAFLD而言是一种重要的方式。本研究结果表明中等强度的运动改善抗氧化能力效果最好，运动对NAFLD大鼠抗氧化的作用，是依赖运动强度的变化。矛盾的是，NAFLD大鼠肝脏中氧化应激标志物MDA的水平降低似乎与运动强度无关，由于在本研究中缺乏ROS和其他氧化应激指标的测试，抗氧化作用对强度依赖性的关系无法进一步证实。Oh等〔18〕提出通过中到大强度的运动，受试者肝脏中脂肪含量和氧化应激水平的有效降低，这可能有助于改善NAFLD。总的来说，这些研究结果提供了NAFLD依赖运动强度的变化，来提高抗氧化能力的直接证据。

肝细胞凋亡的发生主要受死亡受体信号转导途径，线粒体信号通路和ER信号通路的调控。最近研究显示运动上调NAFLD大鼠抗细胞凋亡Bcl-2的表达和Bcl-2/Bax的比例，下调促细胞凋亡的Bax表达，在预防非酒精脂肪肝肝纤维化甚至肝硬化的进程中起到重要作用〔19〕。

研究报道中等强度运动 (开始强度15 m/min 逐渐增加到25 m/min，60 min/d ) 和体育锻炼降低了凋亡信号 (Bax和Bax/Bcl-2)，但只有中等强度运动增加 Bcl-2含量〔8〕。