体外转染BECN1对MG803胃癌细胞自噬及生长的影响

张玉领 李春梅 陈培 薛白

(江苏护理职业学院，江苏 淮安 223005)

自噬是机体清除衰老细胞，维持细胞自身稳态的重要途径。细胞依靠自噬实现对细胞内成分的循环利用，维持正常的生命活动〔1〕。研究发现，自噬对肿瘤细胞的影响是一把双刃剑，自噬在肿瘤发展的不同阶段能够抑制肿瘤产生和转移，是促进肿瘤细胞凋亡的重要途径；而另一方面，自噬能在不利环境中提高肿瘤细胞对应激的耐受能力，维持其生存，完成免疫逃逸〔2，3〕。本研究通过体外转染自噬基因BECN1，观察其对MG803胃癌细胞自噬活性、生长和侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1材料与仪器 人BECN1(NM-003766)plVX-IRES-Puro-3xFlag 细胞转染质粒购自长沙优宝生物科技有限公司，MG803胃癌细胞株购自赛百慷(上海)生物技术股份有限公司。主要仪器：Bio-Rad蛋白电泳及转膜系统(Bio-Rad 公司)、倒置显微镜(奥林巴斯，USA)、Millipore Direct-Q3 实验室纯水/超纯水一体化系统、Eppendorf 低温离心机、电热式压力蒸汽消毒器、PYC-16 CO2培养箱。

1.2细胞培养 将冻存的MG803细胞从液氮罐中取出，迅速置于37℃水浴锅内溶解复苏。培养于含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，37℃，5% CO2培养箱内培养。每3～4 d细胞对数生长期见融合度达70%左右时，将瓶内的旧培养液倒去，加入37℃预热的磷酸盐缓冲液(PBS)，荡洗3次，加入37℃预热的0.25%胰蛋白酶1.5 ml，使细胞充分消化后，加入培养液终止消化，吸管轻轻吹打至细胞完全脱壁，分瓶传代。

1.3细胞转染 将5 μl BECN1模拟物稀释于100 μl无血清培养基中，将5 μl脂质体稀释于100 μl无血清培养基中，而后将BECN1模拟物加入脂质体中，轻轻吹打混合后室温孵育20 min，形成BECN1-脂质体复合物。取对数生长期MG803胃癌细胞，胰酶消化并计数。将消化好的细胞接种至6孔板，每孔接种(2～5)×105个细胞培养24 h，待细胞融合度达70%～80%时，将BECN1-脂质体复合物加入6孔板，每孔200 μl，37℃培养。

1.4细胞划痕实验 在6孔板中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。细胞培养过夜后用枪头在6孔板垂直划痕，枪头垂直，不能倾斜。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。而后放入37℃ 5% CO2培养箱，培养，于划痕后0 h、24 h和48 h分别取样，拍照。

1.5Western印迹法 取对数生长期细胞，于培养瓶中提取蛋白，采用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。取蛋白上样量为50 μg，样品经过十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后，湿转法将胶上蛋白印迹转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2 h，加入微管相关蛋白1轻链(LC)3B抗体4℃冰箱孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后加入二抗，以相应的浓度孵育2 h，经化学发光后，用凝胶图像处理系统Image J分析目标带的灰度值。

1.6统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件进行t检验。

2 结 果

2.1过表达BECN1对MG803胃癌细胞增殖能力的影响 与对照组相比，在转染后24 h、48 h和72 h，BECN1能够显著抑制MG803胃癌细胞的增殖能力(P<0.05)。见表1。

组别0 h24 h48 h72 h对照组148 000±11 700302 000±21 100388 000±24 600430 000±31 300BECN1转染组150 000±10 400221 000±15 3001)285 000±19 2001)310 000±22 9001)

与对照组相比：1)P<0.05

2.2BECN1转染对细胞侵袭的影响 分别于划痕后0 h、24 h和48 h观察MG803胃癌细胞株划痕恢复情况，在划痕后48 h，过表达BECN1的MG803胃癌细胞划痕恢复略差于对照组，而24 h两组无明显差异，见图1。

2.3BECN1转染对MG803胃癌细胞自噬活性的影响 过表达BECN1基因的MG803胃癌细胞LC3B表达量(28 679±2 812)显著高于对照组(6 454±579)。见图2。

图1 细胞划痕实验结果(×40)

图2 BECN1转染对MG803胃癌细胞LC3B表达的影响

3 讨 论

自噬是机体淘汰衰老细胞、清理病原体的有效途径〔4〕，自噬通过调控癌症启动因素，如组织损伤、慢性炎症、DNA损伤和基因组不稳定性等，最终导致肿瘤的发生与发展〔5，6〕。

自噬功能缺陷的细胞由于线粒体受损及大量异样蛋白的聚集会产生大量的活性氧(ROS)，从而引起 DNA 突变及染色体异常，激活癌基因，导致肿瘤细胞形成〔7〕。BECN1 是一种抑癌基因，通过调控细胞自噬调节细胞内环境的稳态〔8〕。在多种恶性肿瘤细胞内，由于BECN1编码区及内含子的突变，使其无法形成自噬核心复合物〔9〕，BECN1的表达缺失与多种肿瘤的发生、发展、预后等密切相关〔10～12〕。研究表明，40%～75%的人类乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中存在BECN1基因缺失，证明BECN1是一种单基因缺失的候选抑癌基因〔13〕，BECN1等位基因缺失的小鼠易发生肝肿瘤、淋巴瘤和乳腺癌〔14〕。逃避程序性死亡(PCD)是恶性肿瘤细胞的特征之一，而自噬的启动是引发衰老和损伤细胞过程的敲门砖，其表达异常直接影响细胞的生物行为。Konishi等〔15〕研究发现BECN1基因敲除的细胞其吞噬功能严重受到影响；而BECN1下调则明显减弱了细胞自噬活性功能〔16〕。因此，BECN1基因在肿瘤细胞自噬的发生发展中具有重要的意义。

LC3是酵母自噬相关基因(ATG8)的同源基因，其表达产物 LC3A 随着自噬过程被启动，当细胞发生自噬时，LC3A转化为LC3B，并定位在自噬体膜上，LC3B 表达量与细胞自噬程度呈正比，是判断细胞自噬活性的特异性分子标志物〔17〕。本研究表明BECN1基因表达的增加能够显著提高MG803胃癌细胞自噬活性。综上，在胃癌细胞中，LC3B表达降低，细胞自噬活性受到抑制。过表达自噬相关基因BECN1能够显著促进LC3B的表达，提高细胞自噬活性。提示自噬相关基因BECN1与胃癌的发生、发展密切相关。