甲壳质酶蛋白40对肾结核的诊断效能及关系研究

陈怀安，刘硕，李秀君，王哲，张潮，李凤岐，苗文隆

（河北北方学院附属第一医院 泌尿外科，河北 张家口 075000）

泌尿结核是最常见的肺外结核，近年来随着耐药结核菌株的出现，其发生率呈上升趋势，其中肾结核最为常见且最早发生。1989年，HANCE将尿聚合酶链反应（PCR）技术应用于结核杆菌检测，但由于技术原因存在局限性，易导致DNA污染致假阳性，而且若结核菌未排入尿中，必然导致假阴性[1-3]。本文探讨甲壳质酶蛋白40（YKL-40）水平与肾结核的关系，分析YKL-40对肾结核的诊断效能，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年8月—2017年8月河北北方学院附属第一医院收治的46例肾结核患者作为研究组，另选取同期来院体检的46例健康志愿者作为对照组。研究组：男性29例，女性17例；年龄31～76岁，平均（52.2±4.5）岁。对照组：男性30例，女性16例；年龄30～78岁，平均（52.5±4.6）岁。纳入标准：①经检查和诊断符合肾结核诊断标准[4]并经病理诊断核实；②自愿参加本研究。排除标准：①有其他结核疾病；②合并其他对研究有影响的严重疾病。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 YKL-40检测所有研究对象晨起抽取空腹静脉血3 ml，3 000 r/min离心15 min收集上层血清。采用酶联免疫吸附法检测研究对象血清YKL-40水平，试剂盒由美国Quidel公司提供，检测过程中严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）①仪器和试剂：采用由德国Gene公司生产的Rotorgene 3000 qRT-PCR仪进行检测，DNA提取试剂盒由美国Sigma公司生产，德国Gene公司提供SYBR实时定量试剂。以β-actin为内参，以特异性结合分支杆菌插入序列IS6110为目的基因。β-actin正向引物：5'-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3'；反向引物：5'-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3'。结核杆菌正向引物：5'-TTGGAAAGGATGGGGTCA-3'；反向引物：5'-CGCAGCCAACACCAAGTAG-3'。所有引物由日本TaKaRa公司设计合成。②检测方法：按试剂盒操作说明书进行DNA提取及标准品制备。反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，58℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40个循环。所得结果以阴阳性表示。阳性：Ct值≤35。每个标准点进行3次重复测量，取平均值，每次实验设立空白对照组。

1.3 观察指标

观察两组血清YKL-40水平，观察肾结核患者病变组织和周围健康组织YKL-40表达水平。对比PCR检测方法，分析YKL-40水平检测对肾结核患者的诊断效能。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；绘制ROC曲线。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清YKL-40表达水平比较

研究组与对照组血清YKL-40水平分别为（29.36±6.52）和（20.06±5.91）ng/ml，经t检验，差异有统计学意义（t =7.168，P =0.000），研究组血清YKL-40水平高于对照组。

2.2 病变组织与周围健康组织YKL-40表达水平比较

肾结核病变组织与周围健康组织YKL-40表达水平分别为（31.52±6.87）和（26.15±5.59）ng/ml， 经t检验，差异有统计学意义（t =4.112，P =0.000），病变组织YKL-40水平高于周围健康组织。

2.3 YKL-40与qRT-PCR检出肾结核阳性率 比较

YKL-40与qRT-PCR检出肾结核阳性率比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.817，P =0.000），YKL-40检出肾结核阳性率高于PCR。见表1。

表1 YKL-40与qRT-PCR检出肾结核阳性率比较

2.4 YKL-40、qRT-PCR对肾结核的诊断效能

YKL-40 ROC曲线下面积为0.930（95% CI： 0.900，0.969），敏感性为76.09%（35/46），特异性为91.30%（42/46），阳性预测值为50.85%（30/59），阴性预测值为96.97%（32/33）。qRT-PCR ROC曲线下面积为0.790（95% CI：0.736，0.849），敏感性为82.61%（38/46），特异性为63.04%（29/46），阳性预测值为20.00%（11/55），阴性预测值为97.30%（36/37）。YKL-40与qRT-PCR ROC曲线下面积比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=4.348，P =0.000）；YKL-40 ROC曲线下面积大于PCR。见图1、2。

图1 YKL-40的ROC曲线

图2 qRT-PCR的ROC曲线

3 讨论

我国结核病人数居全球第2位，是世界上结核病负担最重的国家之一，尤其高发于偏远农村山区。泌尿系结核在张家口偏远农村山区易发、高发，河北北方学院附属第一医院每年收治上百例泌尿系结核患者，其中以肾结核最多见。临床发现肾结核均有影像学表现或临床症状，单纯药物治疗已无法治愈，需手术切除单侧肾脏才能治愈肾结核。所以，如何早期发现肾结核，早期药物治疗保留患者肾脏变得尤为重要。

YKL-40又名人类软骨糖蛋白39或者壳多糖酶-3样蛋白-1，属于哺乳动物壳多糖酶样蛋白家族[5]。 YKL-40蛋白最初是由REJMAN等[6]于1988年从非分泌期牛乳腺分泌物的乳清蛋白中分离发现，并于1992年由JOHANSEN等[7]鉴定和命名。1993年，HAKALA等[8]测出其完整的氨基酸及cDNA序列，结果显示YKL-40是由383个氨基酸组成的单链多肽，N末端3个氨基酸为酪氨酸（Y）、赖氨酸（K）和亮氨酸（L），分子量为40 kD，所以称其为YKL-40。YKL-40从不同类型的细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、间皮细胞、滑液成纤维细胞、平滑肌细胞和恶性肿瘤细胞释放[9]。YKL-40水平在炎症过程中升高，可能在炎症相关细胞的趋化、蓄积和激活中发挥重要作用。YKL-40通过细胞膜激活细胞内途径，发挥几丁质传感器样作用，趋化巨噬细胞并激活感染的抗炎反应[10]。有多项研究分析肺结核、肺癌及其他原因导致胸腔积液以及血清中YKL-40的浓度，结果不太一致，但总体发现胸腔积液中高浓度YKL-40有可能区分渗出液与漏出液，YKL-40胸腔积液/血清浓度之比有可能区分结核性与其他非结核性胸腔积液，证明YKL-40对局部炎症有提示性诊断价值[11]。

关于肾病，目前只在肾移植后患者中分析YKL-40与肾损伤的关系，发现尿中或血清YKL-40浓度与进行性肾损伤相关，可能是肾移植患者群体心血管损伤发病的原因[12-13]。目前尚未见YKL-40在肾结核患者中表达的研究。本文通过分析YKL-40在肾结核和正常对照个体血清中的浓度以及在肾结核组织中的表达情况，并与qRT-PCR方法诊断价值进行比较。结果显示，相对于健康人群来说，YKL-40在肾结核患者血清中的表达水平升高。而在比较肾结核患者病变组织和周围健康组织YKL-40的表达水平时发现，病变组织YKL-40水平也高于健康组织。表明YKL-40可能参与肾结核的发生过程。YKL-40与qRT-PCR诊断肾结核一直是临床研究的重点，由于YKL-40是近年来出现的诊断指标，部分学者仍然习惯性采用qRT-PCR进行检测，认为qRT-PCR对肾结核诊断率较高。但在比较YKL-40和qRT-PCR诊断对肾结核时发现，qRT-PCR检出肾结核阳性率32.61%，YKL-40检出肾结核阳性率47.83%，YKL-40检出肾结核阳性率高于qRT-PCR。比较两种诊断方法对肾结核诊断效能时发现，YKL-40对肾结核的诊断效能优于qRT-PCR。YKL-40可能是通过多种机制在肾结核的发生发展中起到作用，可有效反映肾结核的活动及病变范围，相对于qRT-PCR检测效果更佳。

综上所述，YKL-40的检测对肾结核患者的诊断效能较高。