广西地不容内生真菌DBR-9产橘霉素的发酵条件优化

汤夏安，刘彩莲，邓业成，冯蓓蓓，骆海玉，邓志勇

(广西师范大学 生命科学学院/珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室，广西 桂林 541006)

橘霉素是由青霉属、曲霉属、红曲霉属等真菌产生的一种聚酮类次级代谢产物，常引起粮食和食品污染，但同时也具有广谱的生物活性，包括抗细菌和真菌活性，以及潜在的抗癌活性和神经保护作用[1-2]。前期研究发现，广西地不容内生真菌DBR-9可产生橘霉素，并且显示出广谱的抗植物病原真菌活性，在农用杀菌剂领域具有潜在的开发利用价值。因为在通常条件下内生真菌DBR-9产生橘霉素的量较低，所以通过优化内生真菌DBR-9产橘霉素的发酵条件以提高橘霉素的产量，对橘霉素的开发利用具有重要意义。

响应面法是一种利用合理的试验设计方案，采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析优化工艺参数，预测响应值的统计方法[3]。响应面法具有试验次数少、周期短、精度高等优点，已在食品、医药、生物工程、发酵工程等领域得到广泛应用[4-13]。为此，利用响应面法探索内生真菌DBR-9产橘霉素的最佳发酵条件，以期提高橘霉素的产量，旨在为今后利用内生真菌DBR-9大规模发酵生产橘霉素奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 内生真菌DBR-9从采自广西植物研究所种质园的广西地不容块根中分离获得。

1.1.2 供试培养基 种子培养基：去皮马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂20 g、蒸馏水1 000 mL。发酵培养基：去皮马铃薯200 g、蔗糖20 g、蒸馏水1 000 mL。上述培养基均为自然pH值，且在121 ℃下高压灭菌30 min。

1.1.3 试剂及仪器 磷酸、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、琼脂粉、硝酸钠、硫酸镁、磷酸氢二钾、氯化钾、酵母粉等均购自西陇科学股份有限公司；橘霉素纯品由本实验室分离制得；色谱纯甲醇购自美国天地有限公司；超纯水由美国Milli-Q Reference 超纯水系统制得。安捷伦1260 Infinity液相色谱仪购自美国安捷伦公司；色谱柱Sapphire-C18(4.6 mm×150 mm×5 μm)购自美国赛默飞科技公司；台式高速冷冻离心机H2050R购自湖南湘仪离心机仪器有限公司；LYZ-2102C恒温摇床购自上海龙跃仪器设备公司。

1.2 方法

1.2.1 橘霉素标准液配制 准确称取10 mg橘霉素纯品，用适量色谱纯甲醇溶解，转移至100 mL容量瓶中，用色谱纯甲醇定容至刻度，配制成100 mg/L的橘霉素标准液备用。

1.2.2 橘霉素含量分析 发酵液在12 000 r/min、5 ℃条件下离心10 min，取上清液经0.22 μm水系滤膜过滤，用色谱纯甲醇稀释发酵液(V甲醇∶V发酵液=9∶1)，然后采用HPLC进行分析。参照陈蕴等[14]的方法设定HPLC分析条件：采用C18柱(Sapphire-C18，4.6 mm×150 mm×5 μm)，柱温28 ℃；流动相为甲醇-水(体积比55∶45)，用磷酸调pH值为4.0；流速为1.0 mL/min；紫外检测器波长254 nm；进样体积20 μL。

1.2.3 发酵方法 在种子培养基上接种0.1 mL孢子液并涂布均匀，28 ℃恒温培养10 d。用20 mL无菌水将培养基表面的孢子洗下，并用擦镜纸过滤，制成孢子悬浮液(种子液)，用血球计数板计数后备用。取250 mL三角瓶加入液体发酵培养基100 mL，灭菌后接入孢子悬浮液，置于摇床中26 ℃、160 r/min培养。不同条件处理重复3 次。

1.2.4 单因素试验设计 分别选择葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖作为碳源(设置10、20、30、40、50、60 g/L的质量浓度梯度)，选择硝酸钠、蛋白胨和酵母粉作为氮源(设置0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L的质量浓度梯度)，选择硫酸亚铁、氯化钾、氯化钠和硫酸镁作为无机盐(设置0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g/L的质量浓度梯度)，发酵时间分别设置为5、10、15、20、25、30、35、40 d，初始接种量分别设置为1、2、3、4、5、6个单位(每个单位为5.2×106个孢子)。

1.2.5 Plackett-Burman(PB)试验设计 在单因素试验基础上，应用PB试验确定影响内生菌DBR-9产橘霉素的主要因素。根据单因素试验的结果，确定PB试验设计中的因素高低水平，每个因素2个水平(表1)。其中，因素C、F、J为虚拟因素，用于平衡误差。

1.2.6 最陡爬坡试验设计 在响应面试验中，为了得到有效的响应面拟合方程，所选各个因素的水平必须逼近最优因素水平的区域，因此必须进行最陡爬坡试验。在PB试验中得到影响显著的关键因素基础上，根据PB试验结果所拟合的一阶拟合方程中的变量系数设定关键影响因素的爬坡方向和步长，若变量系数为正，则变量水平需在梯度递增的方向进行爬坡，反之亦然。这样可快速经济地逼近最大响应值区域。

表1 Plackett-Burman试验设计的因素水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman test design

1.2.7 响应面中心组合试验设计 以PB试验所确定的影响显著因素作为试验因素，并以最陡爬坡试验中得到的橘霉素产量最大时的因素水平作为中心点，采用中心组合试验设计原理对产橘霉素的培养条件进行三因素五水平响应面试验，具体设计因素水平见表2。

表2 响应面中心组合试验设计因素水平Tab.2 Factors and levels of response surface center combination test design g/L

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 19.0处理，PB试验和响应面试验的设计和数据统计分析采用Design-Expert 10.0.4软件。

2 结果与分析

2.1 橘霉素标准曲线

将橘霉素储备液用色谱纯甲醇稀释配成质量浓度分别为2.5、5、12.5、25、50、100 mg/L的样品溶液，在设定的色谱条件下进行 HPLC 分析。以峰面积(y)为纵坐标，橘霉素质量浓度(x)为横坐标，得到标准曲线回归方程:y=16.614x-27.282，r2=0.999 4。说明标准曲线的拟合度高，线性关系好。

2.2 发酵单因素试验结果

不同碳源种类及其含量对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响见图1a。橘霉素质量浓度随着碳源质量浓度的增加呈现先升高后下降的趋势。与其他2种碳源相比，葡萄糖效果较好。当葡萄糖质量浓度为40 g/L时，DBR-9发酵产物中橘霉素质量浓度最大，达到578.88 mg/L，故选取葡萄糖为条件优化的碳源。

不同氮源种类及其含量对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响见图1b。与其他2种氮源相比，酵母粉效果较好。当酵母粉质量浓度为1.5 g/L时，DBR-9发酵产物中橘霉素质量浓度最大，达到528.03 mg/L，故选取酵母粉为条件优化的氮源。

无机盐对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响见图1c。随着无机盐质量浓度的增加，橘霉素质量浓度先增大后减小。氯化钾质量浓度为0.3 g/L时，橘霉素质量浓度达到最大值449.67 mg/L。氯化钠质量浓度为0.4 g/L时，橘霉素质量浓度达到最大值455.65 mg/L。硫酸亚铁质量浓度为0.2 g/L时，橘霉素质量浓度达到最大值430.45 mg/L。硫酸镁质量浓度为0.3 g/L时，橘霉素质量浓度达到最大值449.02 mg/L。

发酵时间对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响见图1d。在5～30 d的发酵时间内，橘霉素质量浓度随发酵天数的增加而增加，之后随发酵天数的增加橘霉素质量浓度下降。在30 d时橘霉素质量浓度达到最大值465.07 mg/L。

初始接种量对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响见图1e。当孢子初始接种量为3个单位(5.2×106×3个孢子)时，橘霉素质量浓度达到最大值513.54 mg/L，之后随初始接种量增加橘霉素质量浓度下降。

2.3 发酵PB试验结果

PB试验采用n=12(至多可以分析11个因素)的设计方法，分析了葡萄糖质量浓度、酵母粉质量浓度、发酵时间、初始接种量、氯化钾质量浓度、氯化钠质量浓度、硫酸亚铁质量浓度、硫酸镁质量浓度等8个真实因素和3个虚拟因素共11个因素对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响，试验结果见表3。利用Design-Expert软件进行数据处理和方差分析，结果见表4。由表4可知，葡萄糖质量浓度、酵母粉质量浓度、氯化钠质量浓度对内生真菌DBR-9产橘霉素的影响显著(P<0.05)，因素效应大小依次为葡萄糖>酵母粉>氯化钠，所以选择这3个因素进入下一步优化试验。其他非显著因素的取值根据各因素的效应正负以及大小而定，正效应取高水平，负效应取低水平，即初始接种量为4个单位(5.2×106×4个孢子)、发酵时间为35 d，此外，因为另外3种无机盐氯化钾、硫酸亚铁、硫酸镁对DBR-9产橘霉素影响不显著且远低于上述3个主要因素，为了节省成本、减少操作步骤，在接下来的试验中对发酵培养基不再添加这3种无机盐。

a.碳源的影响；b.氮源的影响；c.无机盐的影响；d.发酵时间的影响；e.初始接种量的影响

表3 Plackett-Burman试验设计及结果Tab.3 Plackett-Burman test design and results

续表3 Plackett-Burman试验设计及结果Tab.3(Continued) Plackett-Burman test design and results

表4 Plackett-Burman试验结果的方差分析Tab.4 Variance analysis of Plackett-Burman test results

注：*表示影响达到显著水平(P<0.05)。

Note: * indicates that the effect reaches a significant level(P<0.05).

2.4 发酵最陡爬坡试验结果

根据PB试验结果，葡萄糖、酵母粉为正效应进行正爬坡，氯化钠为负效应进行负爬坡。根据3个因素的效应大小比例设定它们的变化方向以及步长，具体试验方案以及结果见表5。由表5可知，第3组试验方案即葡萄糖35 g/L、酵母粉1.25 g/L、氯化钠0.35 g/L时，橘霉素质量浓度最大，此时以各因素质量浓度为坐标值所对应的点逼近最大响应值的响应区域。所以以第3组试验方案各因素的质量浓度值作为后续试验的中心点进行响应面中心组合设计分析。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Tab.5 The steepest climbing test design and results

2.5 发酵响应面中心组合试验结果

由表6响应面试验结果分析获得二次拟合回归方程：橘霉素质量浓度Y=642.49+35.94A+93.55B+34.84C+20.14AB+9.38AC+7.14BC-48.70A2-59.65B2-61.49C2。对该回归方程进行方差分析，结果见表7。由表7可知，模型P<0.000 1，表明该模型达到极显著水平。失拟项P=0.145 2>0.05，失拟项不显著，说明试验数据与模型高度符合，因此模型选择正确。该模型R2为0.986 2，AdjR2为0.973 8，两者数值较接近，说明该模型用于实际预测时误差小，可用于实际预测。模型Adeq Precisior信噪比为25.744，可信度高。在回归模型中，A、B、C、A2、B2、C26项的P<0.000 1，表现为极显著，AB项中0.01≤P<0.05，表现为显著，说明上述各项对发酵液中橘霉素产量均有显著影响。

表6 响应面中心组合试验设计及结果Tab.6 Response surface center combination test design and results

表7 响应面模型方差分析Tab.7 Variance analysis of response surface model

注：R2=0.986 2；AdjR2=0.973 8；Adeq Precisior=25.744；*表示差异达到显著水平(0.01≤P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:R2=0.986 2; AdjR2=0.973 8; Adeq Precisior=25.744;* indicates that the difference reaches a significant level (0.01≤P<0.05)，and ** indicates that the difference is extremely significant (P<0.01).

利用Design-Expert 10.0.4软件分别绘制出AB、AC和BC交互项的等高线图和响应曲面图(图2、图3和图4)。因素对响应值的影响程度由响应曲面的陡峭程度反映，曲面越陡峭，说明该因素对响应值的影响越大，反之，则对响应值的影响越小。从响应曲面图(图2b、3b、4b)可以看出，当其中1个因素的值固定在中心水平时，橘霉素质量浓度随另外2个因素的变化先增加后逐步下降，这说明3个因素之间存在明显的交互作用。

2.6 最佳发酵条件的确定与验证

利用Design-Expert 10.0.4软件对回归方程求一阶偏导数，解得最佳发酵条件为葡萄糖38.628 g/L、酵母粉1.474 g/L、氯化钠0.379 g/L，此时橘霉素质量浓度达到最大值699.327 mg/L。在最适因素水平条件下进行验证试验，结果表明，内生真菌DBR-9产橘霉素质量浓度达到692.421 mg/L，与模型预测值无显著差异，说明优化结果可靠。

图2 葡萄糖(A)与酵母粉(B)交互影响的等高线(a)与响应曲面(b)Fig.2 Contour line(a)and response surface(b)of interaction between glucose (A) and yeast powder (B)

图3 酵母粉(B)与氯化钠(C)交互影响的等高线(a)与响应曲面(b)Fig.3 Contour line(a) and response surface(b) of interaction between yeast powder (B) and sodium chloride (C)

图4 葡萄糖(A)与氯化钠(C)交互影响的等高线(a)与响应曲面(b)Fig.4 Contour line(a)and response surface(b) of interaction between glucose (A) and sodium chloride (C)

3 结论与讨论

通过采用单因素试验、Plackett-Burman 试验、最陡爬坡试验、中心组合响应面试验，筛选出适合广西地不容内生真菌DBR-9发酵的最佳培养基成分组合，即酵母粉、葡萄糖、氯化钠质量浓度分别为1.474、38.628、0.379 g/L。在最佳培养基成分组合及初始接种量20.8×106个孢子、发酵时间35 d条件下发酵，橘霉素质量浓度可达到692.421 mg/L，和预测值699.327 mg/L十分接近，与原始发酵液(初始接种量为10.4×106个孢子，采用未额外添加任何物质的发酵培养基发酵30 d)的橘霉素质量浓度581.817 mg/L相比提高了19.01%。研究结果为进一步利用广西地不容内生真菌DBR-9大规模发酵生产抗菌物质橘霉素奠定了基础。

本研究仅在室内进行小瓶发酵试验，并未对广西地不容内生真菌DBR-9进行放大培养以及大型发酵罐培养，有关DBR-9发酵产橘霉素的工业化生产条件还需要进一步摸索。此外，没有对橘霉素大规模快速提取方法进行优化，这也是下一步需要研究的方向。