苜蓿属材料根瘤内生菌的初步分离与鉴定

闫 伟，石凤翎，钱亚斯

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

苜蓿(Medicago)是重要的豆科牧草，具有很强的环境适应能力和高蛋白含量〔1〕。与其共生的根瘤菌(Rhizobium)是有益土壤微生物，通过共生结瘤固氮，能够促进苜蓿的生长和增强土壤肥力〔2-4〕。在根瘤-苜蓿共生系统中,寄主植物在根瘤菌形成类菌体开始固氮前为根瘤菌提供各种营养元素,根瘤菌在形成类菌体后固定空气中的N2，为苜蓿提供生长所必需的氮素〔5-7〕。

而根瘤组织内亦存在其他微生物定殖，相对根瘤菌而言，人们对这些根瘤内生细菌的研究还相对较少，其中研究较多的是分离自根瘤的Agrobacteriumtumefaciens〔8-10〕，另外Burkholderiacepacia也被证实为植物内生菌和根瘤内生菌〔11〕。高俊莲等人〔12〕从沙打旺根瘤上分离出19 株与土壤杆菌相关的株菌，经过数值分类、AFLP、16S rDNA-RFLP分析，表明它们与土壤杆菌亲缘关系较近。目前人们对根瘤内存在土壤杆菌的现象已有一些相关研究，且有了初步认识〔13〕。这些研究主要集中在根瘤内土壤杆菌的鉴定、对共生结瘤的影响、以及其侵入根瘤的途径等方面。早在1976年，Imshentskii等〔14〕就曾报道过土壤杆菌在自然条件下偶尔可以形成非典型的、无固氮能力的无效瘤。

本试验通过对内蒙古西部地区各苜蓿属材料根瘤内生菌进行分离、纯化、形态特征、16SrDNA的初步鉴定，为深入研究苜蓿根瘤内生细菌的结瘤固氮特性和对植株生长的作用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及来源

鉴定菌株是本实验室从内蒙古西部牧草栽培区各苜蓿属材料根部根瘤中分离纯化获得，详见表1。

1.1.2 试剂及仪器

培养基采用YMA培养基：甘露醇10ɡ，酵母粉0.4ɡ、K2HPO40.5ɡ、MgSO4.7H2O 0.2ɡ、CaCl2.6H2O 0.3ɡ、NaCl 0.1ɡ、琼脂18ɡ、dH2O 1000ml、微量元素液4ml(微量元素液：H3BO35ɡ、Na2MoO45ɡ、dH2O至1000ml)配制，于1000ml试剂瓶中调pH至7。培养基均经过高压灭菌锅在121℃的条件下灭菌25min后使用。

革兰氏染色：

(1)结晶紫溶液：结晶紫(10g)、草酸铵(4g)、酒精(100ml)、蒸馏水(400ml)。

(2)碘溶液：碘(1g)、碘化钾(2g)、酒精(25ml)、蒸馏水(100ml)。

(3)碘酒：碘溶液(5ml)、酒精(95ml)。

(4)复染剂：2.5%番红酒精(10ml)、蒸馏水(100ml)。

细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)DP302，PCR试剂盒及琼脂糖凝胶电泳试剂均购置于天根生化科技(北京)有限公司，引物采用细菌通用引物(27F/1492R)由上海生工(Sangon)合成。引物：27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

表1 供试菌株一览表Table 1 Strains for test

1.2 采集地概况

21份菌株均自行采集于4个地点，分别为内蒙古自治区土默特左旗沙尔沁基地(N40°34′54″，E111°46′54″，海拔1050m)、土默特左旗海流基地(N40°31′17，E111°23′46″，海拔1008m)、呼和浩特市内蒙古农业大学新校区牧草栽培基地(N40°41′30″，E111°22′30″，海拔1055m)达拉特旗关碾房农业部草原生态环境野外科学观测试验站(N40°19′7″，E109°59′52″，海拔1030m)。

4个采集地的气候条件接近，均属典型大陆性气候，呼和浩特市、海流、沙尔沁试验区年平均气温5.4℃，一月份最冷，极端最低气温-33.6℃，七月份最热，极端最高气温36℃；年均日照2952h；年平均降水379mm，冬季积雪少；无霜期113-133d，初霜期9月中下旬，终霜期5月末。达拉特旗关碾房试验区年均气温6.1—7.1°C，无霜期135—150d，360mm,年均日照时数约3000h。各采集地地势平坦，土壤主要养分含量见表1。

表2 试验地土壤理化性质Table2 The properties of the soil in the experimental field

1.3 试验方法

1.4.1 根瘤采集

挖取生长1-2年苜蓿属材料带有根瘤的根部，装入塑封袋带回室内。将根部土壤清洗干净，采集淡粉或粉红色饱满的根瘤。

1.4.2 细菌的分离与纯化

配制YMA培养基〔15〕，灭菌备用。将根瘤用0.1%升汞溶液浸泡1分钟后再用无菌水冲洗3遍，置超净工作台中备用。用灭过菌的镊子压碎根瘤菌后加入一小滴无菌水，再用接种环蘸取碾碎的根瘤菌液，在凝固后的培养基上划线，置25℃恒温箱中培养。当根瘤菌落后长至4-5天后再次进行划线纯化培养，经4-5次的分离，待没有杂菌后采用甘油法保藏，并鉴定。

1.4.3 革兰氏染色

将菌株接种于YMA培养基培养至对数生长期；在预先准备好的载玻片上加一接种环水，从固体培养基上挑出少量菌体均勾涂于玻片上，并尽量分散开；在空气中干燥后在酒精灯火焰顶部通过2次，待冷却后用结晶紫溶液染色1min，用水轻轻的冲洗并吸去多余的水；用碘溶液浸没后吸干，再用碘液染色1min，用吸水纸吸去碘液后用碘酒脱色5min；用水洗后吸去表面的水，用番红复染染色5min；结束后用水轻轻冲洗，吸去表面水后掠干，上镜〔16〕。

1.4.4 细菌16SrDNA鉴定

细菌DNA的提取：DNA模板的提取参照试剂盒步骤。

16SrDNAPCR扩增〔17〕：

16SrDNAPCR反应体系体积均为50μl，反应体系组成如下：

2.0μlReactionBuffer(10×) 5.0μldNTPs(10mM)

4.0μl正向引物P1(10μM) 1.0μl反向引物P6(10μM)

1.0μlTaq聚合酶(5U/μl) 0.25μlMgCl2

3.0μl去离子水蒸馏水 33.75μl模板DNA(约 50ng)

总体积 50μl

按上述组分配制好反应液，分装于PCR管中，加入模板DNA混匀后进行PCR反应。PCR反应条件：

95℃ 预变性 5min

94℃ 变性 1min

55℃ 退火 1min36个循环

72℃ 延伸 2min

72℃ 最终延伸 10min

4℃ 保藏

PCR扩增产物的检测

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶，100V、40min水平电泳，凝胶成像系统拍照，目标条带约1200bp。

图1 供试菌株PCR凝胶电泳

16SrDNA序列测定及序列数据分析

将PCR产物送至华大基因公司测序，通过Internet网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上NCBI基因库中的BLAST对所测碱基序列进行同源性比对，选取同源性95%以上的11株细菌，用Mega(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，确定各根瘤菌在微生物系统发育学上的地位。同源性99%以上定义为种水平，95%-99%定义为属水平，95%以下定义为科水平。

2 结果与分析

2.1 苜蓿内生细菌分离结果

经过分离纯化获得21株苜蓿根瘤内生细菌，所有菌株在YMA培养基上培养1天生长少；培养2天开始大量生长，生长3天后，形成明显菌落，大部分菌落表面粘稠、有光泽，菌落均圆形、凸起；显微镜下除菌株H1、H5、H9、SZ为不规则杆状外，其余菌株形态都为杆状；革兰氏染色均为阴性；在进入对数期后(3～4d)，各菌株菌落直径不尽相同，其中菌株H1、H5、H9、SZ直径最小，仅为1～2mm，HH、H2、H7、SJN、SWL等菌株达2～3mm，而H3、H10、SC3可达9～10mm。

表3 苜蓿根瘤内生细菌的形态观察结果Table 3 Results of morphological character tests of endophytic bacteria of Medicago root nodules

各菌株均在生长1天时未见明显菌落，属于停滞期，2天后进入对数生长期，菌落在不断扩大，4天后达到静止期，菌落不在扩大，随后很快进入衰落期，菌落周围开始出现无光泽、干涸的白色代谢物及死亡菌体。

图2 供试菌株纯培养物

2.2 各菌株16SrDNA序列测定结果

由表3可知，21份菌株中，10份属苜蓿中华根瘤菌属(Sinorhizobium)，2份属根瘤菌属(Rhizobium)，4份属假单胞菌属(Pseudomonas)，4份属节杆菌属(Arthrobacter)，1份属土壤杆菌属(Agrobacterium)。在GenBank数据库中，所有菌株均未找到其同源性在95%水平以下的相似菌株，未能获得种水平上的新菌株。

表4 苜蓿根瘤内生菌16SrDNA序列比对结果Table 4 The results of 16SrDNA sequence blast of endophytic bacteriaof Medicago root nodules

3 讨论

各菌株菌落外观差异明显，苜蓿中华根瘤菌与根瘤菌的纯培养物相似，呈乳白色，苜蓿中华根瘤菌的单菌落较根瘤菌单菌落小，可能由于其生长繁殖速度的差异；土壤杆菌的菌落较大，呈透明乳白色；节杆菌菌落较小，呈乳白色，菌落界限不明显；假单胞菌呈微黄色，菌落边缘呈白色。

微生物的生长过程包括停滞期、对数生长期、静止期和衰落期〔18〕，对数生长期是指微生物在迅速生长达到平衡前的一个阶段，之后即进入最利于根瘤菌统计的时期—稳定期生长期，本研究中根瘤菌(Rhizobium)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium)均在生长1天时未见明显菌落，属于停滞期，2天后进入对数生长期，4天后达到静止期，随后很快进入衰落期，且菌落周围开始出现无光泽、干涸的白色代谢物及死亡菌体，说明在根瘤菌的传代培养过程中，培养时间不能超过5d。

土壤中的其他细菌在豆科植物根瘤中的存在是较为普遍的现象，而且它们对宿主及根瘤菌没表现出致病性〔19〕; 它们有多种多样的途径进入根瘤，有的伴随根瘤菌侵入，有的在根瘤成熟后通过根瘤上裂隙渗入，而有的可能早期就已进入植物种子；但是大多数根瘤内生菌单独回接原宿主不结瘤〔20〕，对植物生长影响不大；仅少数具有促进或降低根瘤菌结瘤的效果，但这与植物种类和菌种类型有关〔21〕。由此看来，根瘤内生菌侵染豆科植物根瘤及其与根瘤菌、宿主植物之间的相互作用是一个相当复杂的过程，目前人们对此还没有清楚的认识。

在不同地点采集的菌株，可能与土壤的养分差异、土壤微生物菌群、地区气候条件及与寄主植物等密切相关〔22〕。本研究中，同一苜蓿属材料在不同种植环境下，根瘤中的菌种不同，不同苜蓿属材料在同一种植环境下，根瘤中的菌株也不尽相同。这与以前研究得出的结论相似，采集于同一地点下不同材料上的菌株，其亲缘关系均较近；对于采集于不同地点上的同一材料的菌株可能分属于两个属或同属内亲缘关系较远〔22〕。

4 结论

本研究结果初步表明，苜蓿根瘤中有可培养得到的土壤杆菌、节杆菌、假单胞菌、苜蓿中华根瘤菌、根瘤菌共存，且均可以在YMA培养基上生长；同一苜蓿属材料在不同种植环境下，根瘤中的菌种不同，不同苜蓿属材料在同一种植环境下，根瘤中的菌株也不尽相同。