内皮素-1及其受体在缺血再灌注大鼠脑内的分布特征

史 颖，张健煜，唐 逸，张广慧，何明利

0 引 言

急性缺血性卒中占全部脑卒中的70%～80%［1-2］，血管再通（动静脉溶栓和/或机械取栓）是目前最直接、有效的治疗方法［3］，然而真正从中获益的患者不到总发病人数的5%［4］。此外，恢复缺血区血流灌注后可引起缺血再灌注损伤（cerebralischemiareperfusioninjury，CIRI），其涉及多种病理生理变化，呈现时间、空间上的动态改变。

内皮素-1（Endothelin-1，ET-1）是由32个氨基酸组成的内源性肽，具有强烈的收缩血管作用。内皮素受体（Endothelin receptor，ETR）属G蛋白耦联受体，包含两种亚型：ETRA、ETRB。生理状态下，ET-1与ETRA结合所介导的血管平滑肌收缩效应，和与ETRB结合所介导的血管舒张效应相互均衡，以维持正常血管张力，维持脑血管自动调节功能［5］。脑缺血后，ET-1亦在其病理生理过程中发挥重要作用［6］。

已有学者提出，脑梗死患者血浆ET-1水平显著增高，并与脑缺血发作的持续时间和强度密切相关［7-9］。然而，缺血后脑内ET-1、ETR的含量变化和空间分布特征尚未澄清，阐明此问题有利于进一步明确ET-1与脑缺血后相关脑损伤的关系。因此，本研究制备短暂性大脑中动脉闭塞（（transientMCAO，tMCAO）/再灌注模型，基于前期实验选取典型时间点再灌注12h，观测其梗死半球多个脑区的ET-1、ETRA和ETRB表达水平变化与部位分布特征，为后续相关研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组清洁级雄性SD大鼠12只，体重230～260 g，由扬州大学比较医学中心提供，实验动物合格证号：SCXK（苏）2017-0007。饲养环境：温度24℃，相对湿度50%，12 h自然昼夜循环，保持通风，自由摄食、饮水。依照前期实验结果，梗死半球内ET-1、ETR含量于再灌注12 h较假手术组含量明显增高，因此我们选取再灌注12 h作为典型时间点，以探讨缺血再灌注后脑内ET-1、ETR于脑内的分布情况。将大鼠按照随机数字表法分成假手术组、缺血再灌注组，每组6只。。

1.2 tMCAO模型制备采用大脑中动脉管腔内闭塞法制备tMCAO模型［10］。10%水合氯醛（3.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，常规消毒颈部皮肤，沿颈正中作一切口，外科显微镜下分离暴露左颈总动脉（left common carotid artery，LCCA）、左侧颈内动脉（left internal carotid artery，LICA），左侧颈外动脉（left external carotid artery，LECA）。血管夹暂时夹闭LICA和LCCA，将前端用火烧钝的4.0号尼龙线线栓经LECA上的切口向前推进插入LICA，直至感觉到轻度阻力。2 h后大鼠麻醉状态下抽出线栓，再灌注开始。假手术组大鼠的手术操作与缺血再灌注组相似，但LICA不插入线栓。实验动物清醒后自由饮食饮水。

1.3 免疫组化染色

1.3.1 脑组织切片制备将各组大鼠麻醉后由剑突下剪开皮肤，逐步向上剪开膈肌，充分暴露心脏，经左心室向主动脉插入针头，心脏充盈后剪开右心耳。灌注200 mL等渗盐水，待肝逐渐变白后，再以4%多聚甲醛200 mL灌注直到全身僵硬。迅速断头取脑，置入4%多聚甲醛液中，4℃冰箱内固定2～3 d，取出脑组织PBS冲洗3次，每次10 min，行梯度脱水：50%乙醇30 min，60%乙醇60 min，70%乙醇120 min，80%乙 醇 180 min，90%乙 醇 180 min，100%乙醇中180 min（分2次，每次90 min）。脱水毕两次透明：将脑组织置二甲苯中，每次10 min。然后浸蜡：取出脑组织放置于恒温箱60～70℃的液体石蜡中3～4 h。浸蜡完毕后包埋蜡块，将修好的蜡块置于石蜡切片机中进行连续石蜡切片，切片厚5 μm，防脱片载玻片捞片，室温储存备用。

1.3.2 免疫组化染色二甲苯脱蜡-梯度乙醇复水-蒸馏水、PBS溶液各5 min、3%过氧化氢溶液10 min、PBS溶液洗3次（5 min/次）、柠檬酸盐缓冲液煮沸12 min、PBS溶液洗3次（5 min/次）、5%-BSA室温封闭1 h、羊抗Endothelin A receptor多克隆抗体（1∶100，美国Abcam公司，ab30536）/鼠抗Endothelin 1单克隆抗体（1∶50，美国Abcam公司，ab2786）4℃过夜、PBS溶液洗3次（10 min/次）、二抗室温1h、PBS溶液洗3次（10 min/次）、DAB显色，镜下观察，适时终止。 PBS溶液洗3次（5 min/次）、苏木精30 s、自来水洗10 min、乙醇梯度脱水（85%20 s、90%30 s、95%1 min、100%2 min）、二甲苯透明后中性树胶封固、光镜观察。免疫组化图片使用Image pro plus软件进行图像采集及存档。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（xˉ± s）表示。2组间比较用两独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one way ANOVA），以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠 ET-1的表达纵观各脑区ET-1主要表达于缺血半球的皮层、尾壳核和海马，ET-1阳性表达区呈棕褐色，见图1。大鼠大脑皮层、尾壳核和海马中ET-1的表达量较假手术组明显增高（P＜0.05），见表1。

2.2 各组大鼠大脑中ETRA的表达脑缺血后再灌注中ETRA选择性表达于梗死半球脑室脉络丛、软脑膜血管、大脑中动脉，阳性表达区呈棕褐色，见图2。缺血再灌注组脉络丛、软脑膜血管和大脑中动脉中ETRA的表达较假手术组明显升高（P＜0.05），见表1。

图1 各组大鼠大脑梗死半球不同脑区ET-1的表达（免疫组化染色×200）Figure 1 Expression of ET-1 in different brain regions of the ischemic hemisphere of the rats in the sham operation and ischemia-reperfusion groups（IHC ×200）

图2 各组大鼠大脑梗死半球不同脑区ETRA的表达（免疫组化染色×200）Figure 2 Expression of ETR-A in different brain regions of the ischemic hemisphere of the rats in the sham operation and ischemia-reperfusion groups（IHC ×200）

2.3 各组大鼠 ETRB的表达ETRB主要表达于梗死半球皮层及海马，见图3。缺血再灌注组大脑皮层、海马ETRB的表达较假手术组明显升高（P＜0.05），见表1。

图3 各组大鼠梗死半球不同脑区ETRB的表达（免疫组化染色 ×200）Figure 3 Expression of ETR-B in different brain regions of the ischemic hemisphere of the rats in the sham operation and ischemia-reperfusion groups（IHC ×200）

3 讨 论

本课题组前期通过选取5个不同再灌注时间点，模拟缺血性卒中急性和亚急性期的动态变化过程。结果显示ET-1、ETR含量均于再灌注12h处较假手术组有明显增高，此与Matsuo等［11］检测出不同脑区内ET-1在再灌注6h处达一高峰，且ET-1含量的高表达持续了至少48h大致相符。本文揭示了大鼠脑缺血及再灌注中ET-1及ETR的时间与部位表达特征。因缺血性脑卒中急性期主要表现为强烈的氧化应激损伤［12-13］，且BQ123（ETRA拮抗剂）可降低脑缺血24 h大鼠脑内丙二醛含量、增加谷胱甘肽水平［14］，我们推断，缺血后首个24 h内ETRA以及ET-1水平的增加可能是氧化应激所致，增加的ET-1可能联合脑内其他旁路机制（诸如AKT/eNOS/ROS）共同造成脑损伤［15-17］。此外，Clazosentan（ETRA拮抗剂）仅改善了再灌注72 h和7 d的脑水肿，对再灌注24 h及更早的脑水肿、血脑屏障破坏无显著作用［8］，提示我们再灌注24 h至7 d的ET-1、ETRA可能参与缺血后期脑水肿及血脑屏障损伤。

脑缺血后及再灌注中全脑不同区域ET-1、ETR的表达定位目前报道较少。本实验选取再灌注12h为典型时间点，免疫组化结果得出，假手术组ET-1、ETR的脑内分布与生理状态下无异［7，18］，缺血后两侧脑半球皮层、尾壳核，海马区ET-1阳性信号较强，属缺血半球内最强，而以上脑区恰恰是最不能耐受缺血缺氧的脑组织［19］。先前学者提出，脑缺血后脑组织存在选择性损伤现象，那么ET-1、ETR的分布特征是否与选择性脑损伤相关？据研究，缺血后再灌注期易损脑区GABA能神经元内高表达ECE-2［20］，其参与ET-1合成且发挥作用的最适PH值为5.5（脑缺血环境）［5］，由此我们推断，脑缺血后再灌注中脑内ET-1含量主要来自局部合成，且在各脑区内呈“选择性表达”，其表达定位的脑区与脑组织缺血后选择性损伤的脑区相关。

生理状态下，正常血管肌源性反应、肌张力调节对血流量及灌注压的维持非常重要，该作用很大一部分依赖于脑内ETRA、ETRB的协同作用［21-22］。本实验中，再灌注12h双侧半球内MCA、软脑膜动脉及脉络丛中ETRA的表达增多。结合先前研究：脑梗死后SB234551（ETRA拮抗剂）可明显提高双侧半球脑灌注［23］，我们猜想，ETRA不仅参与生理状态下脑内血管的肌源性反应、肌张力调节，更有可能是脑缺血后再灌注中引起脑血流降低的有害因素，而其机制可能是ETRA引起的血管收缩效应强于ETRB介导的血管舒张效应，使得脑自动调节功能受损。脑缺血后拮抗ETRB能否获得脑保护作用备受争议。本研究中，缺血半球内ETRB于皮层及海马中增生的胶质细胞内高表达。结合先前学者研究，增生的ETRB对脑组织既有害又有利［18，24］，促进星形胶质细胞生长加速能量衰竭的同时，可促进脑源性神经营养因子表达产生脑保护。我们认为，当缺血性脑损伤发生时，脑内增生的星形胶质细胞是ETRB的主要来源，过表达的ETRB兼有损伤及脑保护作用，此为后期阻断/激动ETRB的研究提供了一定的理论参考。

本研究存在以下不足：一是未能实现ET-1、ETR于脑内的共定位；二是缺乏评价脑缺血后大鼠相关受损的神经功能的动态监测，而这些将是本课题组进一步研究的目标。

总之，实验结果显示ET-1，ETR在脑缺血后再灌注中呈“选择性表达”。ETRA的过表达可能是引起脑缺血后脑血流降低的主要原因，ETRB在脑缺血后具体作用机制仍需进一步探索。