Chemerin在乳腺癌小鼠外周血和乳腺组织中的表达及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

张 杰，周雪清，周心怡，刘文慧，刘倩倩，骆耐香

0 引 言

Chemerin又称维甲酸受体应答子蛋白2是由白色脂肪组织分泌的一种趋化蛋白，可作为G蛋白耦联受体趋化因子样受体1的配体，在适应性免疫和固有免疫中均发挥作用［1-2］。此外Chemerin在肥胖、炎症反应、代谢综合征、心血管疾病、银屑病、非酒精性脂肪性肝病和多囊卵巢综合征等多种病理生理过程中发挥作用［3-6］。临床应用方面，组织Chemerin水平已被确定为急性髓系白血病诊断和预后可行的生物学标志物，其特异性和敏感性分别为79%和54%［7］。在肾上腺皮质癌中，血清Chemerin水平也被认定为是一种预后因子［8］。研究显示在乳腺癌细胞表面有Chemerin受体表达［9］。然而，目前对于Chemerin是否能在乳腺癌的发生与发展中发挥作用尚未见报道。因此，本研究以检测乳腺癌荷瘤小鼠外周血和乳腺组织中Chemerin蛋白的表达水平，以及其对乳腺癌细胞的增殖和迁移的影响为目的，探讨Chemerin对乳腺癌的作用及其能否应用于乳腺癌的诊断和预后检查提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级6～8周龄雌性Balb/c小鼠18～22 g，30只，实验动物许可证号：SCXK 湘 2016-0002，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。小鼠饲养于透明的塑料笼子中，每天安排12 h：12 h光/暗周期，温度25℃，湿度70%，通风、光照良好，饲料、饮水及时添加，垫料每天更换。

1.1.2 细胞系自中科院上海细胞库订购小鼠乳腺癌细胞株4T1以及人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231。

1.1.3 实验主要试剂和仪器DMEM培养基、RPMI1640培养基和胰蛋白酶为美国Gibco公司生产；胎牛血清（FBS）购自美国Hyclon公司；人Chemerin重组蛋白（货号：300-66-25）购自美国Peprotech公司；Chemerin中和抗体（兔源，货号：BS-10410R）购自北京博奥森生物技术有限公司；青霉素、链霉素、MTT试剂盒和高效RIPA组织/细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；Chemerin ELISA试剂盒（货号：ab204520）购自Abcam公司；鼠抗鼠β-actin抗体、辣根酶标记山羊抗兔IgG（H+L）和辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（H+L）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。倒置显微镜为奥林巴斯公司产品；分光光度计和凝胶成像系统为Bio-Rad公司产品。

1.2方法

1.2.1 细胞培养4T1细胞与MDA-MB-231细胞采用含10%FBS、1 000 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640完全培养基，MCF-7细胞采用含10%FBS、1000 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中无菌培养，每2～3天传代1次。

1.2.2 小鼠乳腺癌模型构建收集对数生长期4T1细胞，制备成单细胞悬液，将其接种于15只小鼠的第4对乳腺皮下，每只小鼠接种癌细胞的数量为1×105个/100 μL，共接种1次；在另外15只小鼠的相同部位注射等量的等渗盐水作为对照组。使用游标卡尺分别测量肿瘤的长径和短径，当达到2 mm×2 mm，并且对照组无瘤状物形成时，可判断为小鼠乳腺癌造模成功。

1.2.3 ELISA检测乙醚麻醉后采用眼球取血收集小鼠外周血，静置0.5 h，900×g离心15 min，吸取上层血清；手术分别分离荷瘤小鼠和对照组小鼠第4对乳腺，称量30 mg乳腺组织放入300 μL高效RIPA组织/细胞裂解液中，超声破碎，静置0.5 h，4℃，13800×g，离心20 min，收集上清液。ELISA检测血清和上清液中Chemerin蛋白的浓度，具体操作步骤依据试剂盒使用说明进行。

1.2.4 Western blot检测手术分别分离荷瘤小鼠和对照组小鼠第4对乳腺，称量30 mg乳腺组织放入300 μL高效RIPA组织/细胞裂解液中，超声破碎，静置0.5 h，4 ℃，13 800×g，离心20 min，收集上清液。将提取的总蛋白进行电泳，分离不同分子量蛋白，再转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，TBST洗涤。而后孵育兔抗鼠Chemerin抗体（1∶500）、鼠抗鼠β-actin抗体（1∶2000），4℃过夜，二抗室温孵育1 h。ECL法底物显色，凝胶成像系统（Bio-Rad）分析所得条带灰度值，以Chemerin灰度值与内参β-actin灰度值的比值来表示蛋白质的相对含量。

1.2.5 MTT 法 检 测通 过 1、10、100 μg/L 的Chemerin重组蛋白检测Chemerin是否促进乳腺癌的发展，结果显示100μg/L的Chemerin重组蛋白促进作用最明显，并采用100μg/L的Chemerin中和抗体进行反向验证。将对数生长期MDA-MB-231与MCF-7乳腺癌细胞以5×103个/200 μL分别接种于96孔板，37℃、5%CO2恒温培养箱无菌培养24 h，将接种的细胞分组参照文献［10］：空白对照组（只含高糖1640或DMEM培养基，无细胞）、Chemerin重组蛋白组（100 μg/L，无血清培养基进行稀释）以及Chemerin中和抗体组（100 μg/L，无血清培养基进行稀释），每组设置3个复孔，按顺序加入相对应的药物，培养24 h。向每孔中加入20 μL MTT溶液，培养4 h。用1mL注射器吸去废液，每孔加入150 μL DMSO，摇床振荡30 min，酶标仪检测各孔490 nm处吸光度A值［11-12］。

1.2.6 划痕实验检测将对数生长期MDA-MB-231乳腺癌细胞接种于6孔细胞培养板中，将其分组为对照组、Chemerin重组蛋白组（100 μg/L）以及Chemerin中和抗体组（100 μg/L），过夜培养。细胞铺满后，用10 μL移液器枪头沿直尺在每孔划痕，用PBS冲洗细胞划痕3次，去除漂浮细胞碎片，分别加入含有对应蛋白的培养基，37℃、5%CO2恒温培养箱无菌培养。于48 h进行拍照，并测量各划痕的宽度。细胞迁移能力以迁移率表示，公式如下［13-14］：

细胞迁移率=（原划痕宽度-现划痕宽度）/原划痕宽度×100%

1.3 统计学分析应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料以均值±标准差（xˉ±s）表示。多组间数据比较采用One-way ANOVA分析，两组间数据比较采用配对t检验分析。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 乳腺癌荷瘤小鼠外周血与乳腺组织中Chemerin蛋白表达量的变化ELISA结果显示，与正常小鼠相比，荷瘤小鼠的外周血与乳腺组织中Chemerin蛋白的表达量均明显增高（P＜0.05），见表1。Western blot结果显示，荷瘤小鼠的乳腺组织中Chemerin蛋白的表达量（1.561±0.133）亦明显高于正常小鼠（0.910±0.035），差异就有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

表1 小鼠外周血和乳腺组织中Chemerin蛋白表达水平（xˉ±s，pg/mL）Table 1 Chemerin expression level in peripheral blood and mammary gland of mice（xˉ±s，pg/mL）

图1 Western blot检测小鼠乳腺组织中Chemerin蛋白表达水平Figure 1 Detection of chemerin expression in mammary gland of mice by western blot

2.2 Chemerin重组蛋白对乳腺癌细胞的增殖和迁移的影响MTT法和划痕实验结果显示，与对照组比较，Chemerin重组蛋白组MCF-7、MDA-MB-231细胞增殖率和MDA-MB-231细胞的迁移率明显增加（P＜0.01）；Chemerin中和抗体组均降低（P＜0.05）。见表2。

表2 Chemerin重组蛋白对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响（xˉ±s,%）Table 2 Effect of Chemerin neutralizing Antibody on proliferation of breast cancer cells（xˉ±s,%）

3 讨 论

乳腺癌是一种异质性疾病，在我国乳腺癌的总发病率以每年2%～5%的速率增长，已成为我国女性癌症死亡的主要原因之一［15-16］。近年来研究发现，乳腺癌的发生发展与表观遗传学修饰等因素相关，乳腺癌的精准治疗逐渐开始发展［17-18］。研究表明，脂肪组织除了作为能量储存组织之外，还是重要的内分泌组织，其分泌的细胞因子统称为脂肪因子，包括瘦素、脂联素、抵抗素和Chemerin等［19］，其中瘦素、抵抗素等脂肪因子与乳腺癌关系密切，它们均可促进乳腺癌的发生与发展［20-22］。Chemerin是一种相对分子质量为18 000的无活性前蛋白，以自分泌或旁分泌的形式分泌，通过丝氨酸蛋白酶水解切除蛋白的C端部分，生成相对分子质量为16 000的活性趋化蛋白［23］。已知血清Chemerin表达水平与胃癌、肺癌、食管鳞状细胞癌等多种肿瘤的TNM分级、淋巴结转移呈正相关，并对肿瘤细胞的增殖与迁移起促进作用［24-26］，也与结直肠癌的发病率呈线性相关［27-28］。

本研究结果显示，与对照组正常小鼠相比较，实验组荷瘤小鼠的外周血与乳腺组织中Chemerin蛋白的表达水平均有明显的升高，表明Chemerin在乳腺癌的发生与发展过程中发挥了重要作用。同时细胞实验结果显示，与对照组相比较，经由不同浓度的Chemerin重组蛋白处理的乳腺癌细胞后，细胞的增殖与迁移能力均得到提升，浓度越大增殖和迁移能力越强，表明促进乳腺癌细胞增殖和迁移具有浓度依赖性。而经由Chemerin中和抗体处理的乳腺癌细胞的增殖与迁移能力则受到抑制。由此表明，Chemerin对乳腺癌细胞的增殖与迁移均发挥了促进作用，而且其促进作用与Chemerin蛋白的浓度呈浓度依赖性。

在本研究中，明确了Chemerin在乳腺癌个体体内的表达水平明显高于正常对照，以及Chemerin可有效促进乳腺癌细胞的增殖和迁移，但Chemerin在乳腺癌发生与发展过程中发挥作用的机制并未涉及。有文献显示，Chemerin发挥作用的途径可能是通过JNK与ERK1/2信号通路，以及与促进单核细胞浸润和分化为巨噬细胞相关［10，29］。Chemerin对乳腺癌发挥的促进作用是否与上述机制一致，本课题组还将继续开展进一步的研究。本研究结果为Chemerin成为一个乳腺癌筛查指标应用于临床诊断提供了实验依据。