超高效液相色谱—串联质谱同时测定猪肉中传统型和新型瘦肉精

刘 迪 韩 莉 黄 坤 王 亨 余婷婷 王会霞

(1.湖北省食品质量安全监督检验研究院，湖北 武汉 430075；2.湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北 武汉 430075)

“瘦肉精”是一种特定的可用来减少被饲养类动物的脂肪、增加其瘦肉比例的药物的俗称。传统型瘦肉精一般是指β-受体激动剂，是一类人工合成的苯乙醇胺类物质，包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特布他林、异丙喘宁、氯丙那林、西马特罗、非诺特罗等。该类药物在动物性食品中的残留会对消费者身体造成不同程度的影响，对于易感人群危害更为严重[1-2]。而被视为新型“瘦肉精”的喹乙醇并不属于瘦肉精类药物，它不具备传统瘦肉精药物的生物学和化学特点，化学结构也相差甚远，所造成的食品安全危害也不尽相同。喹乙醇为代表的抗生素，是一种化学合成的生长促进剂，可促进机体蛋白质合成代谢，提高饲料能量利用率，增加畜禽养殖效率，减少养殖过程中疾病发生几率[3]，因此可加快畜禽生长发育，提高个体瘦肉率。喹乙醇具有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人体也存在致畸形、致突变、致癌性[4]。喹乙醇本身不稳定，在动物体内可快速代谢，代谢产物中3-甲基-喹喔啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid，MQCA)为喹乙醇的主要代谢产物，在动物体内滞留时间长，且含量与残留关系稳定，能反映喹乙醇的残留情况，被确定为残留标志物[5]。

2002年，β-受体激动剂被列入《食用动物禁用兽药及其他化合物清单》[6]，对于喹乙醇中国禁用于禽及水产养殖，仅允许用作育成猪(体重<35 kg)的饲料添加剂[7]；而欧盟早在1998年就已禁止喹乙醇作为饲料添加剂[8]。现阶段，对β-受体激动剂和喹乙醇及其代谢物的检测方法较多。刘佳等[9]建立了一种猪肝中26种β2-受体激动剂药物残留的反相液相色谱—串联质谱检测方法，26种β2-受体激动剂在 5，10，20 μg/L添加水平的回收率为 64.0%～112.7%，相对标准偏差<15.2%，方法检出限为0.15～1.35 μg/kg；金玉娥等[10]也采用液相色谱—串联质谱测定了猪肉和猪肝中11种β2-受体激动剂，采用内标法定量，可以满足食品安全法规的需要；Zhang等[11]、薛良辰等[12]、欧阳珊等[13]、Bodi等[14]、Merou等[15]、Sniegocki等[16]分别用液相—质谱/质谱测定了喹乙醇及其代谢物的含量，都取得了比较理想的结果。但上述研究的前处理过程都比较复杂，一般包括酶解、提取、固相萃取的过程，比较费时费力。生物样品基质复杂，内源性物质会干扰检测结果。液相串联质谱联用法特异性强、灵敏度高，是现阶段最主要的检测技术手段，但是同时检测β-受体激动剂和喹乙醇及其代谢物的高效液相串联质谱检测分析法未见报道。本试验拟建立同时检测猪肉中β-受体激动剂和喹乙醇及其代谢物的超高效液相串联质谱联用的分析方法，以期为快速检测和监管猪肉中瘦肉精残留提供技术保障，为动物源食品中兽药残留高通量快速分析检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

试验所用样品为市售猪肉，且所有的阴性样品均通过国家标准方法测定验证。

标准品(纯度≥99%)：喹乙醇(olaquindox，CAS号：23696-28-8)、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸(methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic，MQCA，CAS号:74003-63-7)、3-甲基-喹噁啉-2-羧酸-D4(MQCA-D4)、喹噁啉-2-羧酸-D4(quinoxaline-2-carboxylic-D4，QCA-D4，CAS号:879-65-2)、异丙喘宁(Metaproterenol，CAS号：5874-97-5)、氯丙那林(Clorprenaline，CAS号：3811-25-4)、西马特罗(Cimaterol，CAS号：54239-37-1)、特布他林(Terbutaline，CAS号：23031-25-6)、沙丁胺醇(Salbutamol，CAS号：18559-94-9)、莱克多巴胺(Ractopamine，CAS号：97825-25-7)、克伦特罗(Clenbuterol，CAS号：129138-58-5)、非诺特罗(Fenoterol，CAS号：13392-18-2)、沙丁胺醇-D3(Salbutamol-D3)、莱克多巴胺-D3(Ractopamine-D3)、克伦特罗-D9(Clenbuterol-D9)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、甲酸：色谱级，美国Thermo Fisher Scientific公司；

盐酸、氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

试验用水：电阻率≥18.2 MΩ·cm，Milli-Q制备超纯水；

C18、HLB、MCX、MAX、中性氧化铝固相萃取柱：美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪：Acquity UPLC H-class型，美国Waters公司；

串联四级杆质谱仪：Xevo TQ-XS型，美国Waters公司；

电子天平：ME2002E、XS204型，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司；

翻转式混匀器：Trayster型，德国IKA公司；

低温冷冻离心机：Allegra X-15R型，美国贝克曼库尔特有限公司；

氮吹仪：N-EVAP24型，美国Organomation公司；

涡旋混合器：EOFO-945601型，美国亨利特里姆公司；

均质器：T25型，德国IKA公司；

超声波清洗仪：S90H型，德国Elma公司。

1.3 标准溶液的配制

用甲醇分别溶解各种标准品，配制成质量浓度为10 mg/L 的标准储备液和1 mg/L的同位素内标标准储备液，储存于-18 ℃冰箱中，保存期限为3个月。使用时根据需要配成不同质量浓度的中间混合标准溶液，同位素内标液同样按照需要配制成中间混合标准溶液。标准工作液临用前用0.1%甲酸水溶液将标准储备液溶液配制为0.2～20.0 μg/L的同位素内标标准曲线。

1.4 样品的前处理

称取5.00 g捣碎的猪肉，置于50 mL的聚丙烯离心管中；加入100 μL混合同位素内标标准溶液，加入10 mL含2%甲酸的乙腈溶液；匀浆提取1 min，超声提取15 min，4 000 r/min离心5 min；取上清液转移至25 mL比色管中。另取一离心管加入10 mL含2%甲酸的乙腈溶液，洗涤匀浆刀头0.5 min；洗涤液移入前一离心管中，用玻璃棒捣碎残渣，涡旋混匀器涡旋1 min，超声提取10 min，4 000 r/min离心5 min；合并上清液，用含2%甲酸的乙腈溶液定容至刻度，摇匀备用。

准确移取5.0 mL样品溶液至已活化的中性氧化铝固相萃取柱上，用试管收集流出液；用5 mL含2%甲酸的乙腈溶液洗涤中性氧化铝柱，收集全部流出液，于45 ℃ 下氮气吹干，用1.0 mL含0.1%甲酸水溶液溶解残渣，超声振荡1 min；加入3 mL正己烷溶液，涡旋2 min，4 000 r/min 离心5 min；取下层溶液经0.22 μm滤膜过滤后供液相色谱—串联质谱测定。

1.5 UPLC条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；柱温：35 ℃；进样量：5 μL；流动相：A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱程序如下：0.0～1.0 min，A保持95%不变；1.0～2.5 min，95%～50% A；2.5～3.0 min，A保持50%不变；3.0～4.0 min，50%～5% A；4.0～5.0 min，A保持5%不变；5.0～5.1 min，5%～95% A；5.1～7.0 min，A保持95%不变；流速：0.25 mL/min。

1.6 质谱条件

离子源为电喷雾离子源(ESI源)，扫描方式采用正离子模式，检测方式采用多反应监测(MRM)；毛细管电压2.8 kV，离子源温度120 ℃，脱溶剂气温度400 ℃，锥孔气为高纯氮气，流量150 L/h；脱溶剂气为高纯氮气，流量800 L/h，碰撞气为高纯氩气。各物质的质谱多反应监测条件如表1所示。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的确定

根据这些化合物的化学结构和性质，在正离子扫描模式下，用蠕动泵按照化合物的绝对响应，以一定的速度对标准物质进行流动注射分析，对质谱参数进行优化处理。通过一级质谱全扫描模式分析确定分析物的分子离子，调试选择最佳的毛细管电压和锥孔电压，找到[M+H]+丰度最高的作为母离子，接着对分析物母离子进行二级质谱分析，获取碎片离子信息，优化碰撞能量等相关参数；选择信噪比最强和次强的两个子离子分别作为定量和定性离子，同位素内标物质只需要选择信噪比最强的子离子。最终确定的质谱的多反应监测条件参数见表1。

表1 各目标化合物的质谱参数†Table 1 Mass spectrometry parameters of each target compound

† *为定量离子。

2.2 色谱条件的确定

根据β-受体激动剂苯环上取代基的差异，可分为苯胺型和苯酚型。苯酚型β-受体激动剂极性较大；苯胺型β-受体激动剂、喹乙醇以及MQCA为中等极性极性。β-受体激动剂一般是弱碱性化合物，而喹乙醇及其化合物为酸性化合物。这些目标化合物在C18柱上都有好的保留效果，碱性化合物在中等pH值流动相条件下的峰形容易出现拖尾。本研究对比了Waters ACQUITY UPLC HSS C18和Waters ACQUITY UPLC BEH C18分析目标物时的效果，这两支色谱柱的粒径<2.0 μm。ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱采用三键键合C18配体和专有的端机封尾技术，可以改善碱性化合物的峰形，还能有效抑制酸性条件下键合相的水解。

前期预试验结果表明：采用Waters ACQUITY UPLC HSS C18柱分析样品时，各化合物的峰形更优，并且各化合物之间的分离度更优。因此，本研究选用Waters ACQUITY UPLC HSS C18色谱柱。同时，在正离子模式下加入一定量的甲酸可以提高离子化效率和分离度，比较了甲醇、乙腈分别作为有机相与0.1%甲酸溶液组成流动相的效果。乙腈作为有机相时比甲醇作为有机相时各物质的灵敏度略高，故选用乙腈—0.1%甲酸溶液作为流动相。在优化的色谱条件下，各化合物的峰形尖锐，并且可以在7 min内完成目标物的分离和色谱柱的分离。各目标化合物的选择离子流色谱图见图1。

2.3 提取方式的选择

β-受体激动剂和喹乙醇及其代谢物的提取方式，大多为水解后通过后续净化再检测。水解方式包括酶解[17-18]、酸解[19-20]、碱解[21-22]。酶解过程条件温和，但需要16 h以上，耗时长且步骤繁琐，而且不适合这两类物质的同时检测；强碱水解效果好，可以有效水解蛋白质，但是反应通常较为剧烈，会造成有些化合物(如MQCA)的降解；酸水解反应较碱水解温和，但是提取后经固相萃取柱净化后，有些化合物的提取效率和回收率达不到要求。

为达到同时检测这些物质的要求，本研究拟采取有机相均质提取的方式，物理性破坏细胞，可以大大缩短操作时间，简化试验步骤。一般选用的有机相有乙酸乙酯和乙腈，而喹乙醇及其代谢物必须在酸性环境下才能被提取出来，试验对比了2%甲酸乙酸乙酯和2%甲酸乙腈的提取效果，结果见图2。由图2可以看出：提取溶剂对沙丁胺醇-D3提取回收率影响最大，内标的回收率为绝对回收率，绝对回收率太低会影响方法的检出限；对于QCA-D4和MQCA-D4而言，用2%甲酸乙腈的提取效率要略低于2%甲酸乙酸乙酯，可能是因为乙腈可以沉淀一部分蛋白质，也会带入一部分水溶性杂质，会造成基质减弱效应，需要后续的净化过程；对于其他化合物，两种提取溶液对于相对回收率无太大影响。综合考虑，本研究采用 2%甲酸乙腈作为提取剂以均质方式提取，以尽量增大提取的绝对回收率。

2.4 净化条件的优化和内标物的选择

动物样品中一般含有大量的内源性物质，必须通过净化减小基质对检测的干扰。一般净化的方式有固相萃取法和液液萃取法。液液萃取法净化效果较差，且耗费大量的试剂；而固相萃取法净化效果好，试剂用量少。本研究采用固相萃取法净化。

图1 各目标化合物的选择离子流色谱图Figure 1 Selected ion chromatogram of each target compound

图2 不同提取溶液对提取效率的影响Figure 2 Effect of different extraction solutions on extraction efficiency

一般动物源性食品提取液净化常用的固相萃取柱有：C18、MCX、MAX、HLB和中性氧化铝。首先，对比了C18、MCX、MAX、HLB 4款柱子，提取液先用氮吹仪吹干后用水复溶，上样、淋洗、洗脱，经比较发现，喹乙醇在C18固相萃取柱上绝对回收率很低；在HLB固相萃取柱上苯酚型β-受体激动剂的绝对回收率很低；而MCX 固相萃取柱仅对弱碱性的β-受体激动剂有保留；MAX固相萃取柱仅对酸性的喹噁啉类药物有保留。这几种柱子都可以较好地完成净化过程，消除大部分基质的影响，但是并不适用于所有的目标化合物。

本研究选用了中性氧化铝固相萃取柱，样品提取液直接通过经乙腈活化过的中性氧化铝固相萃取柱，后用乙腈洗脱中性氧化铝柱，收集全部流出液，吹干后0.1%甲酸水复溶。结果表明：基质净化的效果理想，各化合物的回收率均可达到要求。试验过程中发现，当加大乙腈洗脱量时，苯酚型β-受体激动剂的绝对回收率有明显的提升，为确保目标化合物收集完全，最终选用5 mL乙腈的洗脱量。

表2是经中性氧化铝小柱净化前后各目标化合物的基质效应对比，和各化合物的绝对回收率与相对回收率的对比。所有目标化合物峰面积较净化前都有较大程度变大。这表明动物样品中待测物的检测存在严重的基质抑制效应，基质效应为-45.2%～-86.2%；而净化后基质效应有了一定程度的改善，为-29.3%～-49.2%。

为了补偿检测过程中的基质效应，本试验采用同位素内标标准曲线法进行定量。由表2可以看出，各化合物的绝对回收率在35.1%～66.4%，根据内标的绝对回收率匹配与之绝对回收率相差不大的化合物，通过同位素内标标准曲线校正后相对回收率可达94.4%～107.1%，均可以达得到满意的补偿效果。

表2 净化前后各目标化合物的基质效应及各化合物的绝对回收率和相对回收率†Table 2 Matrix effects of each target compound before and after purification and absolute recovery and relative recovery of each compound %

† a为采用沙丁胺醇-D3为内标；b 为采用QCA-D4为内标；c 为采用MQCA-D4为内标；d为采用莱克多巴胺-D3为内标；e为采用克伦特罗-D9为内标。

2.5 标准曲线和检出限

将各种目标化合物标准工作溶液用0.1%甲酸水溶液稀释，分别配制成浓度为0.2～20.0 ng/mL的系列标准工作曲线，按照1.5和1.6中所确定的液相条件和质谱条件进行检测。以目标化合物质量浓度为横坐标，目标化合物的峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，拟合线性曲线，结果见表3。表3结果表明：在质量浓度0.2～20.0 μg/L 浓度范围内目标化合物均呈良好的线性关系，相关系数R2≥0.996 2。

对阴性样品进行加标，经前处理后的样液进行检测，根据目标化合物色谱峰信号强度的S/N=3和S/N=10得出猪肉中非诺特罗、莱克多巴胺和氯丙那林的检出限和定量限分别为0.1，0.3 μg/kg；克伦特罗的检出限和定量限分别为0.05，0.20 μg/kg，其他化合物的检出限和定量限分别为0.2，0.5 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

以不含目标分析物的阴性猪肉样品进行加标回收率和精密度试验。准确称取猪肉样品5.0 g，设定3个添加水平(检出限、2倍检出限、10倍检出限)，混匀后根据1.4方法进行提取、净化和测定，每个添加水平重复测定6次，计算添加平均回收率和相对标准偏差，其回收率和相对标准偏差见表4。由表4可知：猪肉中各目标化合物的回收率为89.1%～121.5%，相对标准偏差为2.6%～12.9%(n=6)。

表3 猪肉中各目标化合物的回归方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Regression equation,correlation coefficient,detection limit and limit of quantification of each target compound in pork

表4 猪肉中各目标化合物的回收率和精密度Table 4 Recovery and precision of each target compound in pork (n=6)

2.7 实际样品的测定

应用本方法对2018年下半年武汉地区采集的20份猪肉样品进行检测，均未检出β-受体激动剂和喹乙醇及其代谢物。

3 结论

本方试验用2%甲酸—乙腈溶液提取，中性氧化铝小柱净化，正己烷去脂，液相色谱—串联质谱检测，建立了准确定性定量检测猪肉中8种β-受体激动剂和喹乙醇及其代谢物残留量的方法。本方法成本低，操作快捷简单，灵敏度较高，重复性好，能够用于应急检测或日常猪肉中传统型和新型“瘦肉精”残留监测，也为动物源食品中不同性质的兽药残留高通量快速分析检测提供一定的技术参考。但是，本研究检测基体较为单一，今后可扩大检测基体量、研究不同基体的前处理方式的优化以及如何更加有效去除内源性物质的干扰，以期达到更全面、严格管理这类药物使用和残留监测的目的。