ASPE-UPLC-MS/MS测定动物源食品中痕量五氯酚及其钠盐

陈彦宏 陈 穗 宋安华 黄景初 陈悦铭 刘 佳 王 宇,

(1.广州市食品检验所，广东 广州 511400；2.广东美味鲜调味食品有限公司，广东 中山 528437)

五氯酚(pentachlorophenol，PCP)及其钠盐属高毒有机氯农药，被广泛应用于防腐、抗菌、杀虫、除草等方面。中国主要将五氯酚用于吸血虫中间宿主钉螺的灭杀，稗草的防治，皮革、木材的防腐，以及养殖水体的消毒、清塘等[1]。五氯酚化学性质稳定，不易降解，具有生物蓄积作用，致畸、致癌、致突变等毒副作用，被国际癌症研究机构IARC列为2B类致癌物[2]。五氯酚钠具有较好的水溶性，可通过水载体广泛传播，进入食物链并产生生物蓄积[3]。五氯酚进入高等动物体内，可通过血液参与机体循环，与血液中细胞、功能蛋白等发生作用，抑制生物代谢过程的氧化磷酸化，影响肝、肾、中枢神经等器官、组织的正常生理活动[4]。农业部公告第193号及第235号规定，所有动物源食品中禁止使用五氯酚及其钠盐[5-6]，动物性食品中不得检出。《国家食品安全监督抽检实施细则(2018年版)》也明确规定畜禽肉及其副产品须检测五氯酚及其钠盐项目[7]。因此，建立灵敏度高、重现性好、可用于确证动物源食品中痕量五氯酚及其钠盐残留的检测方法显得尤为重要。

目前，针对五氯酚及其钠盐常用的检测方法有气相色谱法(GC)[8-10]、气相色谱—质谱法(GC-MS)[11-13]、液相色谱法(LC)[14-16]、液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)[17-19]、免疫分析法[20]等。GC和GC-MS需柱前衍生，操作繁琐；LC灵敏度不高，定性较差；LC-MS/MS具有灵敏度高、选择性强等特点，已广泛运用于动物源食品中兽药残留及非法添加物的确证检测。GB 23200.92—2016为动物源食品中五氯酚的测定提供了依据，但该法规使用基质标准曲线进行定量，当同时检测多种不同类型样品时，需配制多条基质标准曲线，基质复杂，操作繁琐。

本研究拟运用全自动高通量柱式固相萃取系统，在GB 23200.92—2016的基础上，优化样品前处理方法，采用内标法定量，研究提取溶液的选择、固相萃取条件的选择与优化、内标的选择等对测定结果的影响，建立显著降低基质效应、响应度高、定性定量准确的检测方法，以满足食品安全监管中大批量实际样品的测定分析。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

猪肉、猪肝、鸡肉、鸡蛋、红立鱼、明虾、大闸蟹、鲜牛奶：市售；

C18固相萃取柱：500 mg/6 mL，天津博钠艾杰尔科技有限公司；

Oasis HLB固相萃取柱：200 mg/6 mL，美国Waters公司；

Oasis MAX固相萃取柱：150 mg/6 mL，美国Waters公司。

五氯酚钠(PCP-Na)标准品：批号Lot 94492，纯度86.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

五氯酚-13C6(PCP-13C6)标准品：批号Lot M-310，纯度99%，加拿大CDN公司；

五溴酚(PBP)标准品：批号Lot 160473，纯度99.6%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈：色谱纯，美国Fisher公司；

三乙胺：分析纯，德国CNW公司；

氨水、甲酸、盐酸、乙酸铵：分析纯，广州化学试剂厂；

试验用水：一级水，经Synergy超纯水系统纯化的超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.1.2 仪器与设备

超高效液相色谱仪：UPLC-30A型，日本Shimadzu公司；

三重四级杆质谱仪：Triple Quad 5500型，美国AB SCIEX公司；

全自动高通量柱式固相萃取系统：SPE1000-8型，美国LabTech公司；

分析天平：UW6200H型，日本Shimadzu公司；

分析天平：CP225D型，德国Sartorius公司；

均质机：T18 digital ULTRA-TURRAX型，德国IKA公司；

旋涡混合器：MS 3 digital型，德国IKA公司；

涡旋振荡器：Multi Reax型，德国Heidolph公司；

离心机：Allegra X-30R型，美国BECKMAN公司；

氮吹仪：N-EVAP 112型，美国Organomation公司；

超纯水系统：Synergy型，德国Merck公司。

1.2 试验方法

1.2.1 提取溶剂的选择 称取2.00 g均质猪肉样品若干份于50 mL离心管，分别使用10 mL乙腈、5%三乙胺乙腈、2%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，体积比)、5%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，体积比)、8%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，体积比)、2%氨水—乙腈、5%氨水—乙腈和8%氨水—乙腈充分提取，均质1 min，旋涡混合5 min，8 000 r/min 离心3 min，收集提取液。

1.2.2 固相萃取条件的确定

(1)固相萃取柱的选择：使用1.0，5.0，10.0 μg/kg添加水平下的猪肉样品，比较C18、Oasis HLB和Oasis MAX固相萃取柱的萃取回收率。

(2)洗脱液的选择：确定使用Oasis MAX固相萃取柱后，比较4%甲酸—甲醇、6%甲酸—甲醇、8%甲酸—甲醇、10%甲酸—甲醇、0.2%盐酸—甲醇、0.4%盐酸—甲醇等不同酸度的酸性甲醇溶液的洗脱能力。使用甲醇、水活化Oasis MAX柱，移取5 mL提取液以1 mL/min流速通过固相萃取柱，用5 mL 5%氨水溶液、甲醇、甲酸—甲醇—水溶液(2∶49∶49，体积比)淋洗，气推抽干，分别使用5 mL 4%甲酸—甲醇、6%甲酸—甲醇、8%甲酸—甲醇、10%甲酸—甲醇、0.2% 盐酸—甲醇和0.4%盐酸—甲醇洗脱，收集洗脱液。

(3)定容溶剂的选择：洗脱液于40 ℃下氮气吹至近干，分别用水、乙腈和乙腈—水溶液(50∶50，体积比)定容至2.0 mL，经0.22 μm滤膜过滤，供液相色谱—串联质谱仪测定。

1.2.3 超高效液相色谱—串联质谱法条件的确定

(1)质谱条件：使用电喷雾电离负离子(ESI-)多反应监测模式(MRM)，气帘气(CUR)0.206 9 MPa(即30.0 Psi)，碰撞气(CAD)0.062 1 MPa(即9.0 Psi)，电喷雾电压(IS)—4 500 V，离子源温度(TEM)500 ℃，雾化气(GS1)0.344 8 MPa(即50.0 Psi)，辅助气(GS2)0.344 8 MPa (即50.0 Psi)，选定母离子对，优化去簇电压(DP)、射入电压(EP)、碰撞电压(CE)和碰撞室射出电压(CXP)。

(2)色谱条件：色谱柱为Kinetex C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量5 μL，以乙腈为流动相A相，比较水、5 mmol/L乙酸铵水溶液和5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液为流动相B相时的分离效果，选择最佳流动相。

(3)基质效应与内标的选择：配制猪肉、猪肝、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、虾、蟹和牛奶样品的基质标准曲线，与相应浓度的溶剂标准曲线比较，研究基质效应。基质效应(ME)=[(基质标准曲线的斜率÷溶剂标准曲线的斜率)-1]×100%。比较五氯酚-13C6和五溴酚的性质，选择合适内标。

1.2.4 方法学考察

(1)线性关系与定量限：使用乙腈—水溶液(50∶50，体积比)逐级稀释标准储备液，加入内标，制得0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg/L的标准工作溶液，内标浓度1.0 μg/L。以五氯酚与内标的峰面积之比为纵坐标y，浓度为横坐标x，加权后进行线性回归。进样量5 μL，计算目标物峰高与基线噪声的信噪比(S/N)，以S/N=10为仪器定量限，并测定空白样品加标回收后的信噪比，确证方法定量限。

(2)准确度与精密度：在猪肉、猪肝、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、虾、蟹和牛奶样品中各添加1.0，5.0，10.0 μg/kg五氯酚，重复测定6次，计算加标回收率和相对标准偏差(RSD)。

1.3 数据处理

采用Excel 2016进行数据整理、分析，并绘制图表。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的确定

由表1可知，提取回收率随着提取溶剂中碱浓度的增加而增加，当碱浓度增加至一定程度后，回收率趋于稳定，且提取溶剂中含水的提取效果优于不含水的。5%三乙胺的乙腈—水溶液(70∶30，体积比)和5%氨水乙腈提取效率相近，此方法最终选用5%氨水—乙腈进行提取。动物组织内部的五氯酚以结合态存在[21]，提取前需将其水解(加酸或加碱)或酶解成游离态。加碱可调节溶剂pH值，PCP的pKa为4.74[22]，当pH>pKa+2个单位时，PCP发生离子化，呈游离的离子形态。

表1提取溶剂对猪肉加标样品中五氯酚提取回收率的影响
Table 1Extraction percentage of pentachlorophenol from pork spiked samples by different extraction solvents(5 μg/kg)

提取溶剂回收率/%乙腈64.05%三乙胺—乙腈72.22%三乙胺的乙腈—水溶液76.95%三乙胺的乙腈—水溶液83.28%三乙胺的乙腈—水溶液80.12%氨水—乙腈74.85%氨水—乙腈85.48%氨水—乙腈80.4

2.2 固相萃取条件的确定

2.2.1 固相萃取柱的选择 由图1可知，在1.0，5.0，10.0 μg/kg 添加水平下，Oasis MAX柱的萃取回收率最佳，Oasis HLB柱次之，C18柱最差。这是由于C18柱更适合于非极性到中等极性的化合物，对强极性的五氯酚吸附保留效果较弱。HLB柱为亲水亲脂平衡柱，是适用于酸性、中性和碱性化合物的通用型小柱，对极性化合物的保留需提供较好的水浸润性环境，对水样品中五氯酚的回收率较好，但对动物源食品中五氯酚的回收率一般。Oasis MAX柱为一种混合型的阴离子交换柱，其填料为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物基质-CH2N(CH3)2C4H9。碱性环境下，呈酸性的五氯酚发生离子化，带电荷，其酚羟基表现为1个负电荷的阴离子，酚羟基与MAX柱填料上表现为1个正电荷阳离子的季铵基发生离子交换作用，使五氯酚被强吸附并保留于MAX柱上[17]。因此，最终选用Oasis MAX固相萃取柱进行净化。

图1 固相萃取柱对猪肉中五氯酚萃取回收率的影响Figure 1 Extraction percentage of pentachlorophenol from pork by different solid phase extraction columns

2.2.2 洗脱液的选择与优化 由图2可知，随着甲酸浓度的增加，洗脱液的洗脱能力逐渐增强。盐酸的酸度强于甲酸，洗脱液中加入微量盐酸同样可实现五氯酚的洗脱，但由于盐酸酸度过强，洗脱下部分强吸附的干扰物质，基质干扰加重，影响回收率。因此，最终选用10%甲酸—甲醇进行洗脱。

使用酸性甲醇洗脱，主要是利用其酸性pH可中和被吸附的阴离子，使其去离子化，不再与填料上的季铵基产生静电吸引。当pKa-2个单位

图2 酸性甲醇溶液浓度对五氯酚洗脱能力的影响Figure 2 Elution ability of acid methanol solution with different acid concentration on pentachlorophenol

2.2.3 定容溶液的选择与优化 分别使用水、乙腈和乙腈—水溶液(50∶50，体积比)定容，发现水中未检测到目标物五氯酚；乙腈中五氯酚峰型较差，出现溶剂效应；乙腈—水溶液(50∶50，体积比)中五氯酚峰型良好。因此，最终选用乙腈—水溶液(50∶50，体积比)进行定容。五氯酚钠水溶液经酸化至pH为6.6～6.8时，将全部转化为五氯酚析出[3]。MAX固相萃取时，酸性甲醇洗脱液已使五氯酚钠转化为五氯酚。五氯酚钠易溶于水，而分子形态的五氯酚难溶于水，可溶于多数有机溶剂。

2.3 超高效液相色谱—串联质谱法条件的确定

2.3.1 质谱条件的确定 五氯酚是一种氯代酚类物质。五氯酚所含苯环中存在共轭双键，使π键电子云完全平均化，每个碳—碳键的键长和键能均相等，故五氯酚具有较强的稳定性。五氯酚分子离子([M-H]-)在三重四级杆碰撞室内不易被打碎，当碰撞能量(CE)增加至较大程度也只能使母离子裂解出1个[Cl]-，较难获得特征子离子，如图3所示。

图3 五氯酚m/z 262.8离子的产物离子扫描质谱图Figure 3 Production scanning mass spectrum of pentachlorophenol m/z 262.8 ion (CE -40 V)

因此，利用五氯酚中氯元素的35Cl和37Cl两种同位素，选定4个同位素母离子对(262.8>262.8，264.8>264.8，266.7>266.7和268.7>268.7)进行定性定量分析，满足确证要求[23]。其中，定量离子对为262.8>262.8，定性离子对为264.8>264.8，266.7>266.7和268.7>268.7，具体条件见表2。

2.3.2 色谱条件的确定 比较水，5 mmol/L乙酸铵水溶液和5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液3种流动相后发现，以水为流动相，五氯酚峰型较差，影响定量准确；以5 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相，峰型改善，但保留性较差，易受强极性杂质干扰；以5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液为流动相，峰型尖锐，保留增强。因此，最终选用5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液为流动相B相，与乙腈(A相)组合进行梯度洗脱，梯度洗脱程序见表3。五氯酚为强极性的酸性化合物，C18色谱柱上保留较差。流动相中加入甲酸，可降低pH值，使五氯酚以分子形态存在，水中溶解性降低，极性减弱，获得较好保留；同时可降低色谱柱残余硅羟基的活性，降低五氯酚与硅羟基的次级相互作用，获得较好色谱峰型。加入乙酸铵，可提高五氯酚的离子化效率，提高灵敏度[3]，改善峰型，具有缓冲作用，能维持流动相pH值稳定。

2.3.3 基质效应与内标选择

(1)基质效应：液相色谱—质谱分析中，受共流出干扰物和电离竞争抑制的影响，目标物的质谱信号会小于或大于相同浓度的溶剂标准溶液的响应值，存在基质效应。基质效应影响分析的灵敏度、准确度和精密度。稀释样品基质、净化样品基质、优化色谱分离条件和质谱分析条件、使用内标物、配制基质标准曲线等可减小基质效应[24]。

表2 五氯酚、五氯酚-13C6和五溴酚的质谱条件Table 2 Mass spectrum conditions of pentachlorophenol,pentachlorophenol-13C6 and pentabromophenol

表3 流动相梯度洗脱程序Table 3 Gradient of mobile phase

通过配制猪肉、猪肝、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、虾、蟹、牛奶等样品的基质标准曲线，与溶剂标准曲线比较，测得猪肉、猪肝、鸡肉、鸡蛋、鱼肉、虾、蟹和牛奶的基质效应分别为-22.8%，-32.3%，-23.6%，6.0%，10.8%，-34.8%，-25.9%，-7.1%。其中，鸡蛋、鱼肉、牛奶因含水量较大，基质效应较低，为弱基质效应(|ME|<20%)，其他样品为中等强度基质效应(20%≤|ME|≤50%)[25]。当同时检测多种不同类型样品时，需配制多条基质标准曲线，基质复杂，操作繁琐。故本研究采用内标法定量，简化操作。

(2)内标物的选择：通过比较五氯酚的同位素内标五氯酚-13C6和性质相近的卤素内标五溴酚，由图4可知，五氯酚-13C6和五氯酚m/z只相差6，而基于氯元素的同位素选择母离子对，五氯酚-13C6和五氯酚存在相同母离子对268.7>268.7，质谱信号发生叠加，影响定量定性结果。因此，最终选用五溴酚作为内标。

图4 五氯酚、五氯酚-13C6和五溴酚的一级质谱图Figure 4 Mass spectrum of pentachlorophenol,pentachlorophenol-13C6 and pentabromophenol

2.4 方法学评价

五氯酚在0.2～10.0 μg/L范围内线性关系良好，回归方程为y=0.600 75x+0.030 01(r=0.999 38)，定量限为1.0 μg/kg。由表4可知，五氯酚的回收率为86.0%～106.0%，相对标准偏差为1.62%～4.27%。由图5可知，五氯酚和五溴酚的色谱分离效果良好，无杂质峰干扰。此方法灵敏度高，重现性好，准确度和精密度较高。

3 结论

本研究对提取溶剂、固相萃取柱、洗脱液、质谱分析和色谱分离条件、内标物等进行了优化，建立了动物源食品中五氯酚及其钠盐测定的全自动固相萃取—超高效液相色谱—串联质谱法。样品中加入五溴酚内标，经5%氨水—乙腈提取，运用全自动高通量柱式固相萃取系统，Oasis MAX固相萃取柱净化，5%氨水溶液、甲醇、甲酸—甲醇—水溶液(2∶49∶49，体积比)淋洗，10%甲酸—甲醇溶液洗脱，氮吹浓缩后用乙腈—水溶液(50∶50，体积比)定容，以乙腈和5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱，Kinetex C18色谱柱分离，利用氯的同位素选定母离子对并进行质谱分析测定。在不同动物源样品基质下，该方法分离效果良好，灵敏度高，准确度和精密度较好，能满足动物源性食品中五氯酚及其钠盐残留的确证分析要求，后续可进一步研究并建立动物源食品中多种氯酚类化合物的测定方法。

表4不同样品中五氯酚的回收率和相对标准偏差
Table 4Extraction percentage and relative standard deviations of pentachlorophenol in different samples(n=6)

样品加标量/(μg·kg-1)测定值/(μg·kg-1)回收率/%RSD/%1.00.8787.04.13猪肉5.04.7194.23.4210.09.8298.22.321.01.06106.04.27猪肝5.04.6693.23.9010.09.5695.63.881.00.9494.04.05鸡肉5.04.9298.43.1610.09.7297.23.041.00.9292.03.15鸡蛋5.05.02100.42.3910.09.6596.52.661.00.9393.03.27鱼肉5.04.7294.42.4610.010.09100.91.621.00.8686.02.15虾 5.04.8296.43.1810.09.6696.63.631.00.8989.03.43蟹 5.04.5791.42.8910.09.2592.53.271.00.9595.02.94牛奶5.04.7294.41.9510.09.6196.12.08

图5 猪肉加标样品的MRM质谱图Figure 5 MRM mass spectrum of pork spiked sample (5 μg/kg)