冠心病病人血浆中相关炎性因子水平及其与TIPE2的关系研究

冠心病是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称，是临床常见的心脑血管疾病[1]。目前，冠心病的发病机制尚未完全明确，但是已经有研究证实单核细胞趋化因子（MCP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、可溶性血管内皮细胞间黏附分子1（sVCAM-1）、 白细胞介素 1（IL-1）、IL-6、IL-8 等炎性因子与动脉粥样硬化的发生发展密切相关[2]。TIPE2是2008年发现的一种新型抗炎蛋白，能够通过抑制炎症反应而对动脉粥样硬化发挥抑制作用[3]。本研究旨在观察冠心病病人血浆中相关炎性因子水平及其与外周血单个核细胞（PBMCs）中TIPE2之间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2016年1月至2018年6月于我院收治的50例冠心病病人为观察组，其中男37例，女13例，年龄 54～78岁，平均（62.42±8.66）岁；隐匿性冠心病9例，心绞痛27例，心肌梗死8例，心力衰竭及心律失常6例。纳入标准[4]：（1）经冠脉造影显示，任意一支冠状动脉管腔面积狭窄超过50%的病人；（2）来诊前3个月未给予糖皮质激素治疗的病人；（3）对本次研究知情同意。排除标准[5]：（1）未给予冠脉造影检查的病人；（2）合并急慢性炎症的病人；（3）合并瓣膜性心脏病的病人；（4）过敏性体质病人；（5）合并肿瘤以及癌前病变的病人；（6）合并免疫性疾病病人；（7）合并过敏性疾病的病人；（8）合并溃疡性结肠炎的病人。另选择同一时期至我院进行健康体检的健康人员50例作为对照组，其中男31例，女19例，年龄50～80岁，平均（63.77±8.29）岁。 2组病人性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究已通过医院伦理委员会审核批准。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集：观察组病人在行冠脉造影前取清晨空腹静脉血3 mL，采血管为肝素抗凝管，使用离心机3000 r／min离心15 min，吸取下层红细胞，将剩余血液再次离心后，吸取上部大部分血浆，于-80℃冰箱中保存备用。行冠状动脉造影的同时取动脉血3 mL，加入淋巴细胞分离液进行分离，吸取中间白膜层即为PBMCs，行TIPE2 mRNA检测。对照组在体检时采集清晨空腹静脉血3 mL、桡动脉血3 mL，采集方法同观察组。

1.2.2 炎性因子检测：采用酶联免疫吸附试验法检测血浆中 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8的含量。相关试剂盒均购自R＆D公司，均由我院生化实验室进行检测，检测过程严格按照试剂盒说明书要求操作。采用美国公司生产的全自动酶联检测仪检测样品的吸光度，根据标准曲线和标准公式计算样品浓度。

1.2.3 TIPE2 mRNA检测：采用 RT-PCR法检测TIPE2 mRNA水平。Trizol购自美国Gibco BRL公司，Taq酶购自大连宝生物公司，模板 RNA 2μg、MMLV逆转录酶购自美国Promega公司。引物由上海生工生物工程公司合成。采用Trizol法提取组织总RNA，反应条件为95℃预变性5 min，94℃ 1 min，68℃ 30 s，72℃ 40 s，共计 29个循环，72℃延伸 10 min。PCR反应产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min，使用UVIpro凝胶图像分析系统（美国KODAK公司）进行摄像、扫描、分析。所有操作严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件处理分析研究中的所有数据，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以百分（%）表示，组间比较采用χ2检验，采用Pearson相关系数分析TIPE2 mRNA的相对表达量与相关炎性因子表达水平之间的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组相关炎性因子表达情况 观察组病人MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表达水平均明显高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。 见表 1。

表1 2组相关炎性因子表达情况（±s，n＝50）

表1 2组相关炎性因子表达情况（±s，n＝50）

注：与对照组比较，∗∗P＜0.01

炎性因子 对照组 观察组MCP-1（pg／mL） 102.47±8.22 135.72±20.56∗∗MMP-9（pg／mL） 114.29±10.28 176.39±25.47∗∗TNF-α（mg／mL） 20.03±2.94 25.33±5.12∗∗sVCAM-1（pg／mL） 92.33±11.58 149.36±30.27∗∗IL-1（pg／mL） 21.50±4.29 42.33±10.44∗∗IL-6（pg／mL） 11.29±2.53 18.44±4.07∗∗IL-8（pg／mL） 31.40±6.16 41.05±6.81∗∗

2.2 2组TIPE2 mRNA的相对表达量比较 观察组TIPE2 mRNA相对表达量为16.29±1.57，明显低于对照组的21.33±1.37，差异具有统计学意义（t＝17.103，P＜0.001）。2组凝胶电泳图见图1。

图1 2组TIPE2凝胶电泳图

2.3 TIPE2 mRNA的相对表达量与炎性因子的相关性分析 Pearson相关性分析结果显示，TIPE2 mRNA的相对表达量与 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8的表达水平均呈负相关，差异具有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。 见表2。

表2 TIPE2 mRNA的相对表达量与炎性因子的相关性分析

3 讨论

冠心病是临床常见的心血管疾病，随着人类饮食结构的变化，冠心病发病率呈现逐年升高的趋势[6]。病人以心前区压榨性疼痛为主要临床症状，发作时可伴随呼吸急促、大汗淋漓、呕吐甚至昏厥，具有较高的致死率，严重的冠心病可对病人的生存质量造成重大影响，并带来严重的经济负担。有数据统计发现，2009年中国城市居民冠心病死亡率为94.96／10万，农村为71.27／10万[7-8]。因此冠心病的治疗和预防成为临床研究的重要课题之一。

冠心病的病因尚未完全明确，但临床认为炎症因子在疾病的发生和发展过程中起到重要作用[9]。MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 等炎性因子已经证实与冠心病密切相关[10]。MCP-1属于趋化因子CC家族，主要在血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞中表达，能够与趋化因子受体相结合，通过细胞膜上特有的信号通路激活单核细胞或巨噬细胞，从而参与动脉粥样斑块的一系列炎性反应。MMPs属于内肽酶家族，具有锌离子依赖的特性[11]。MMPs是人体内降解细胞外基质的主要酶类，能够对肿瘤周边细胞所构成的屏障进行降解，从而破坏细胞间的黏附力。MMP-9属于MMPs中的明胶酶，被称为明胶酶B，具有降解明胶的作用，因此在粥样斑块的发生中起到重要作用。TNF-α是由单核细胞和巨噬细胞合成的，具有多种生物学功能，在免疫功能调节和炎症反应中具有重要作用，而且能够通过触发细胞因子之间的级联反应促使粥样硬化的形成和发展[12]。sVCAM-1大量存在于血液中，可促进炎症细胞与血管内皮细胞黏附，引发血管内皮损伤，诱导血管收缩，增加心脏缺血缺氧。研究已经证实sVCAM-1水平与远期心血管不良事件的发生率呈正相关[13]。IL-1也称为淋巴细胞刺激因子，主要由活化的单核-巨噬细胞产生，能够通过促进B细胞的增殖和分泌抗体发挥免疫调节作用。IL-6主要由单核-巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞等产生，能够分别刺激B细胞和T细胞活化，通常刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应[14]。IL-8主要由单核-巨噬细胞产生，其他细胞能够在适宜的刺激条件下产生少量，已经证实在冠心病的炎症发展中具有重要作用。

TIPE2是一种新型的抗炎蛋白，属于TNF-α诱导蛋白8家族，研究发现TIPE2能够通过对T细胞受体和T细胞TOLL样受体信号途径进行负向调节，从而起到负性调控作用，以此维持机体内环境的稳定性，实现机体的免疫耐受。由于TIPE2是在2008年才发现的新型蛋白，其研究较少，虽然已经证实其在维持免疫稳态中的作用以及在抗动脉粥样硬化过程中的作用，但是与冠心病病人血浆中相关炎性因子关系的研究较少。从本次研究来看，观察组病人 MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表达水平均明显高于对照组（P＜0.01），说明上述炎症因子在冠心病的发生发展过程中具有重要意义。观察组TIPE2 mRNA相对表达量明显低于对照组（P＜0.05），这是因为TIPE2是通过核因子（NF）-κB信号通路维持炎性细胞因子和抗炎因子的平衡，健康人群中二者平衡比较稳定，因此TIPE2水平较高，但是冠心病病人中这一平衡被打破，炎症因子水平明显升高，TIPE2水平降低。相关分析发现TIPE2的相对表达量与MCP-1、MMP-9、TNF-α、sVCAM-1、IL-1、IL-6、IL-8 的表达水平均呈负相关（P＜0.05或P＜0.01），说明 TIPE2具有抑制病人相关炎症因子的作用。这是因为TIPE2能够通过抑制TLR和T细胞受体的表达减少NF-κB的激活，而后者的激活是炎性因子释放和分泌的必要途径，因此TIPE2能够抑制炎症的发生，所以在本次研究中TIPE2与各种炎性因子均呈现出负相关。

综上所述，冠心病病人血浆中相关炎性因子与PBMCs中TIPE2的表达呈负相关，TIPE2能通过抑制相关炎性因子的表达起到抗冠状动脉粥样硬化的作用，但是本次研究样本量较小，后续仍需要大量研究来探讨TIPE2在冠心病中的作用机制，从而为冠心病的预防和治疗提供新途径。