眶内电针法与眶内针刺法对大鼠动眼神经损伤后眼外肌功能及动眼神经的作用

滕金艳，胡少勇，汪泽栋

(1.湖北省中医院针灸科，湖北 武汉 430074；2.湖北省中医院神经外科，湖北 武汉 430074；3.温州医科大学附属第一医院针推理疗科，浙江 温州 325000)

动眼神经是第三脑神经，来源于胚胎中脑的基底板，通过上眶裂进入眼眶并支配外在眼肌，调控完成眼球转动和抬闭眼睑等动作[1]。动眼神经还包含支配内在眼肌的纤维，通过调控瞳孔收缩改变焦距以发挥调节视觉质量等作用[2]，其损伤会影响眼外肌功能。半乳糖凝集素-1(Galectin-1)[3]是半乳糖凝集素家族成员之一，研究发现其广泛分布于神经系统，参与神经系统的发育，促进神经损伤后的保护，可用于成体神经性疾病预后的评估。本文旨在研究大鼠动眼神经损伤后，不同治疗方案对眼外肌功能的影响及对动眼神经损伤修复作用，为动眼神经损伤修复提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物模型制备 选取体重>220 g成年雄性SD大鼠(许可证号：SYXK(鄂)2015—0029)，适应性饲养1周后制备动物模型。(1)暴露动眼神经：所有动物均经右侧额颞入路暴露动眼神经。将大鼠麻醉后左侧卧位，剃毛备皮，常规消毒、铺巾，于耳前缘切L型切口，逐层切开皮肤、皮下组织、颞肌，双极电凝血止血后，骨膜剥离器分离颞肌，将皮肤肌肉用牵开器向嘴耳连线两边撑开，高速磨钻于暴露视野中央钻孔，咬骨钳将骨窗扩大约0.3 cm×0.2 cm，将颅底侧硬脑膜悬吊，小心剪开硬脑膜，打开硬脑膜显露脑组织后，用含8 万IU庆大霉素的0.9%生理盐水冲洗手术区，显微镜下用一逐渐变细的小脑压板轻抬起梨状叶，可见海绵窦后段游离于天幕缘的动眼神经。(2)动眼神经损伤：追踪游离动眼神经干，并于海绵窦后段适当处，在显微镜下用枪状镊对动眼神经进行夹闭5 s，使轴突断裂，但保持髓鞘完整，损伤完成后关闭手术窗，硬脑膜复位不缝合，骨窗覆盖明胶海绵，然后逐层缝合颞肌，缝合皮肤。(3)动眼神经损伤模型成功标志：上睑下垂、眼球外展位固定、眼球运动不能、瞳孔散大、瞳孔对光反射消失。(4)术后护理：术后7 d每天腹腔注射抗生素1次，术后2 d每天注射镇痛药。术后7 d皮肤伤口拆线。以上研究均符合动物伦理学研究标准。

1.1.2 动物分组 随机选取模型制备成功大鼠21只，随机分为模型组、眶内电针刺组(A组)、眶内针刺组(B组)各7 只，选取仅暴露动眼神经未进行动眼神经损伤SD大鼠7 只为假手术组，选取未进行任何手术处理的SD大鼠7 只为空白组。术后大鼠以平板托置，单笼饲养，自由摄食、饮水。

1.2 方法

1.2.1 治疗方法 空白组、假手术组、模型组不予治疗，A组与B组均针刺内直肌、提上睑肌。内直肌位于目内眦，将大鼠眼球向目外眦推压，沿眼球与眶内壁之间近乎垂直进针，进针深度约0.3 cm；提上睑肌位于眼球上方，将大鼠眼球向目下方推压，沿眼球与眶内壁之间进针，进针深度约0.3 cm。A组分别以内直肌和提上睑肌为电针导线的正负极，通以电流为5 Hz的连续波，强度以动物耐受、实验者可见针体轻微极小幅度颤动为宜，在眼眶内、眼外肌周围形成弱电场。B组内直肌与提上睑肌各刺入2 根针灸针。每次治疗15 min，每日治疗1次，治疗6 d间隔1 d为1个周期，共治疗4个周期。

1.2.2 观察指标 于治疗结束次日检测观察以下指标。(1)瞳孔直径：动物保持清醒状态，在暗室内标准光刺激并记录瞳孔直径。头部制动，用手术显微镜光束(强度230 000 lux，距离200 mm)直接照射瞳孔，并在眼休息位，垂直于眼球横断面拍照。采用Image-Pro Plus 5.0软件测量患侧瞳孔直径。(2)睑裂大小：动物保持清醒状态，自然光条件下，双眼处于休息位，垂直于眼眶平面采集图像，用采用Image-Pro Plus 5.0软件测量上、下睑缘中点之间的距离，确定睑裂大小。(3)眼外肌肌肉张力：采用肌肉张力换能器(肌肉张力换能器及生物信号采集系统，由成都泰盟科技有限公司提供，型号：LMSZ1002)检测眼外肌肌肉张力，刺激频率为10 HZ。(4)半乳糖凝集素-1(Galectin-1)mRNA表达：实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测动眼神经中Galectin-1 mRNA表达。RNAiso PlUS液提取总RNA；超紫外分光光度计测定RNA纯度，以A260nm/A280 nm>1.8为纯度合格；琼脂糖凝胶检测总RNA的完整性，以可见紫外光检测仪254 nm下，28 s与18 s两条条带的亮度比约为2：1为片段完整；合成cDNA，反应条件：37 ℃，5 min；37 ℃，15 min；50 ℃，5 min；98 ℃，5 min、4 ℃进行逆转录。引物序列：Galectin-1上游 5'-TCGTGTGCAACAGCAAGGACG-3'，下游5'-TTGGCCTGGTCGAAGGTGATG-3'，长度112bp，GAPDH序列：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，长度225 bp，PCR反应条件：95 ℃，5 min预热；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；72 ℃，20 s扩增40 个循环；样品10 倍梯度稀释进行实时定量检测，制作标准曲线，PCR反应条件：50 ℃，2 min；95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s；荧光读取Ct值；根据各样品中的拷贝数，用内参作为校正，每个样品均测量3次，取平均值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同治疗方案对大鼠眼外肌功能的影响结果

与空白组相比，假手术组在瞳孔直径、睑裂、眼外肌张力方面差异无统计学意义(P>0.05)，模型组在瞳孔直径、睑裂、眼外肌张力方面差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，A组瞳孔直径小于模型组、睑裂及眼外肌张力大于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)；B组瞳孔直径小于模型组，差异无统计学意义(P>0.05)、睑裂及眼外肌张力大于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同治疗方案对大鼠眼外肌功能的影响结果

*P<0.05，与空白组相比；#P<0.05，与假手术组相比；△P<0.05，与模型组相比。

2.2 不同治疗方案对大鼠动眼神经损伤的作用结果

由统计结果可知，与空白组相比，假手术组与模型组Galectin-1 mRNA相对表达量低于空白组，其中模型组差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术组相比，A组与B组Galectin-1 mRNA相对表达量低于假手术组，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，A组与眶内针刺组Galectin-1 mRNA相对表达量高于模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 Galectin-1 mRNA表达量结果

*P<0.05与空白组相比；#P<0.05，与假手术组相比；△P<0.05，与模型组相比。

3 讨论

动眼神经是支配眼球运动的重要神经，损伤后可引起眼球外观、眼球活动以及视野等功能障碍[4-5]，严重影响患者的生活质量。动眼神经损伤的病因颇为复杂，包括颅内动脉瘤、颅内肿瘤、头部外伤、眶内病变以及脑血管病变等[6]。Sheshadri等[7]研究发现，再生的神经纤维有助于恢复靶器官非特异性支配眼外肌的功能，但目前此观点并没有大量基础研究数据证实。因此，动眼神经损伤后如何进行神经功能重建是目前医学研究的难题。俞大雄等[8]研究发现，针刺疗法可有效缓解动眼神经麻痹状态，基于此，本文设计随机对照实验，评价不同治疗方案对大鼠眼外肌功能的影响及对动眼神经损伤的修复作用。

本研究采用破坏动眼神经轴突的方式制备动物模型，因为该方法有外在创口，存在感染、手术复苏失败等导致动物死亡的可能，故选择“先制备模型，后分组”的研究方法，以保证各组研究例数。在造模过程中动物头部摆放姿势、切口位置与大小、骨窗大小、术中颅内压的控制及术后护理均为模型制备结果的影响因素。Galectin-1称为β-半乳糖苷结合动物凝集素[9]，是一种周围神经切断后的修复因子，在神经元群中呈高表达状态。研究[10]发现神经切断术后Galectin-1 mRNA表达上调，作用类似于神经营养因子，且伴随炎症因子表达下降，表明Galectin-1通过促进增殖，增强轴突神经损伤再生修复功能。此外，Galectin-1 mRNA的上调可能会增加面部神经中的Galectin-1分泌，过多分泌的Galectin-1短暂氧化成为氧化Galectin-1，氧化Galectin-1是体内周围神经损伤再生修复的必需物质[11]。眼外肌功能结果显示，与空白组相比，模型组具有统计学意义，说明纳入研究的动物模型制备成功，实验结果具有可比性。眶内电针法与眶内针刺法与模型组相比均具有显著差异，说明两种方法可改善动物模型的眼外肌功能，但眶内电针法的瞳孔直径低于眶内针刺组，睑裂及眼外肌张力高于眶内针刺组，说明电针法对眼外肌功能的改善优于针刺法。动眼神经损伤的结果显示眶内电针组与眶内针刺组Galectin-1 mRNA相对表达量均高于模型组，提示治疗后动眼神经轴突或神经元增加。

有学者认为，Galectin-1可与小胶质细胞相互作用而起到促进神经功能恢复作用，小胶质细胞分为经典途径激活的小胶质细胞(M1)和旁路途径激活的小胶质细胞(M2)，M1被认为有神经破坏作用，而M2被认为有神经保护作用。Galectin-1通过PI3K途径抑制M1的活化，上调M2的表型。本研究认为，针刺方法刺激自主神经，增加自主神经响应，而电针在针刺的基础上结合电生理学，除了增加自主神经兴奋性还可以调节神经递质代谢，上调Galectin-1 mRNA表达量，利于神经损伤恢复。孙晋茜等[12]在研究视神经损伤修复时发现，电针法与针刺法均可改善动眼神经损伤，与本研究结果一致。

综上所述，动眼神经损伤后修复是当前医学研究热点，眶内电针法与眶内针刺法均可通过上调Galectin-1 mRNA相对表达量，改善眼外肌功能，对动眼神经起到修复作用，为临床修复动眼神经研究提供参考。