植物促生菌DM在胁迫条件下产多胺成分的变化

刘 秀，郑宜令，李艳秋，范亚军

（长春师范大学生命科学学院，长春 130032）

多胺作为一类带正电荷的小分子脂肪族化合物，广泛存在于原核生物与真核生物体内，在微生物细胞中多胺参与细菌的增殖与分化，维持细胞膜及核酸的稳定性［1］。在酸性条件下，多胺通过控制转录与翻译过程诱导细菌产生精氨酸脱羧酶（adiA）、鸟氨酸脱羧酶（speF）和赖氨酸脱羧酶（cadA），并进一步诱导产生多胺以适应酸性条件［2，3］。 Tkachenko 等［4］的研究结果表明，多胺可以通过上调rpoS、rmf、yqjD基因的表达促进抗生素条件下休眠细胞的形成，促使细菌产生抗药性，可见多胺参与细菌的多种应激过程。

在高等植物体内，多胺在多个方面参与植物的生长过程［5-7］。 Ahmed 等［8］通过转基因技术研究表明，过表达多胺转运基因OsPUT1的拟南芥与野生型相比延迟开花16 d，而多胺转运put5基因突变株比野生型提前开花4 d，表明多胺在影响植物生长发育及形态建成方面具有非常重要的作用。不仅如此，近年来的研究发现，多胺参与植物非生物胁迫条件下的抗逆调节，外源多胺能够降低干旱、涝害、盐胁迫等对植物造成的伤害［9-13］。

在前期研究工作中，作者所在项目组利用精氨酸为惟一氮源从羊草根际土壤中筛选出一株对植物具有促生作用的阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）菌株DM，促生试验结果表明该菌能够显著提高西红柿苗在NaCl胁迫条件下的抗逆能力，结合外源多胺与植物抗逆关系的报道，项目组推测阴沟肠杆菌菌株DM在胁迫条件下产生的多胺成分发生变化，进而影响植物逆境条件下的生长发育。本研究对不同胁迫条件下该菌产多胺成分进行了初步分析，为进一步明确其促生作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 所用植物促生菌为阴沟肠杆菌菌株DM，由作者所在实验室筛选、鉴定并保存。

1.1.2 试剂 试验所用腐胺、亚精胺、精胺标准品均购自Solarbio科技有限公司；苯甲酰氯购自Aladdin试剂公司；乙腈、甲醇购自美国Fisher公司；乙醚购自北京精细化学品有限公司。

1.1.3 培养基 ①ADF液体培养基。KH2PO44 g，Na2HPO46 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，葡萄糖 2 g，葡萄糖酸 2 g，柠檬酸 2 g，精氨酸 2 g，pH 7.2，定容至 1 L，高压灭菌后备用。②ADF固体培养基。ADF液体培养基1 L加入15 g琼脂粉，高压灭菌后备用。③含不同NaCl浓度ADF培养基。取等体积ADF培养基，加入不同质量 NaCl， 使其终浓度分别为 50、100、150、200、250、300 mmol／L，高压灭菌后备用。 ④不同 pH的ADF培养基。取等体积ADF培养基，分别调节pH 至 5、6、7、8、9、10，高压灭菌后备用。

1.2 试验方法

1.2.1 菌体培养 从-70℃冰箱取出冻存菌种，在ADF固体培养基上划线培养12～16 h。挑取单菌落于10 mL液体培养基中培养12～16 h。吸取等量菌液接种于不同pH及不同NaCl浓度的培养基中培养（每个梯度重复5次）12～16 h。吸取菌液100 μL加入96孔板，利用酶标仪测定吸光度OD600nm（每个梯度重复3次）。

1.2.2 多胺衍生 DM菌体10 000×g离心5 min，收集上清液，将上清液于-70℃冰箱中过夜冷冻。用冷冻真空干燥仪冷冻72 h，将样品冻干，用5 mL去离子水溶解冻存液，取2 mL进行衍生试验。2 mL样品置于10 mL离心管中加入1 mL氢氧化钠（2 mol／L）、20 μL苯甲酰氯，漩涡混匀30 s，置于37℃水浴20 min，中间每隔5 min振荡30 s。衍生完毕后加入1 g氯化钠，2 mL乙醚，漩涡振荡混匀30 s静置，溶液分层后将乙醚层移至5 mL离心管中，用氮气吹干。加入1 mL甲醇溶解，用滤膜抽滤，作为液相色谱分析上样。

1.2.3 多胺标准品的衍生及萃取 准确称取腐胺、亚精胺及精胺分别配制各样品1 mg／mL储备液，稀释各储备液至0.1 mg／mL工作液。将稀释后的工作液进行衍生和萃取，吹干后加入1 mL甲醇溶解，用滤膜抽滤后备用。

1.2.4 高效液相色谱检测标准品及样品 柱温为室温；流动相为 A（乙腈）、B（H2O），检测波长为 254 nm；进样量为 10 μL。

2 结果与分析

2.1 不同NaCl浓度对DM菌体浓度的影响

等体积不同NaCl浓度ADF培养基接种相同体积的DM菌液，每个NaCl浓度重复5次，培养12～16 h后测定菌体OD600nm。 结果（图1）表明，加入NaCl后 OD600nm下降，NaCl 浓度在小于 200 mmol／L时菌体OD600nm变化不大；NaCl浓度高于200 mmol／L时，OD600nm明显下降。

图1 不同NaCl浓度对DM菌体浓度的影响

2.2 不同pH对DM菌体浓度的影响

等体积不同pH的ADF培养基接种相同体积的DM菌液，每个pH重复5次，培养12～16 h后测定菌体OD600nm。结果（图2）表明，DM菌在pH 7时菌体浓度最高，在酸性及碱性条件下菌体生物量下降。

2.3 不同NaCl浓度对DM菌产多胺的影响

菌体离心后将上清液冻干，按常规方法进行衍生及萃取，甲醇溶解后进行液相色谱分析。结果（图3）表明，DM促生菌在对照组中（NaCl浓度为0）可检出腐胺、亚精胺及精胺，其中以亚精胺含量较高，菌液中腐胺、亚精胺含量随着培养基中NaCl浓度的升高而增加；结合定量分析结果可知，NaCl浓度为150 mmol／L时多胺浓度达到高峰值，随后下降。

图2 不同pH对DM菌体浓度的影响

2.4 不同pH对DM菌产多胺的影响

高效液相色谱检测不同pH条件下DM菌产多胺成分的变化，通过与标准品对比，pH 5的培养液上样10 μL几乎不能检出腐胺，但可检出亚精胺和精胺；pH 6、7的培养液中可检出3种多胺，pH 8时亚精胺和腐胺含量达到高峰，随后开始下降（图4）。

图3 液相色谱检测不同NaCl浓度条件下DM菌产多胺成分变化

3 讨论

图4 液相色谱检测不同pH条件下DM菌产多胺成分变化

近年的研究表明，多胺参与植物非生物胁迫条件下的抗逆调节，其通过与多胺转运体共同决定植物体内多胺的稳态，并进一步激活或抑制基因表达调节植物的生长发育［7］。体外喷施亚精胺能抑制水胁迫下膜透性的增加［9］；腐胺可以降低镉金属胁迫对植物的损伤，同时腐胺可能参与协调植物螯合肽的生物合成来参与植物的应激反应［10］。另外多胺能够清除植物体内氧自由基，提高超氧化物歧化酶（SOD）及过氧化物酶（POD）活性，降低膜脂过氧化作用，减缓叶片衰老，抵御干旱及盐胁迫，提高番茄高温胁迫下花粉萌发率［12，13］。 本研究所用植物促生菌为阴沟肠杆菌菌株DM，前期的研究表明该菌在盐胁迫条件下具有明显的促生作用（尚未发表），为了进一步明确该菌的促生机制，本研究利用高效液相色谱对不同胁迫条件下该菌产多胺成分进行了初步分析，在NaCl胁迫下，培养液中NaCl浓度影响DM菌生物量，随着NaCl浓度升高，菌液中腐胺、亚精胺、精胺浓度升高，在150 mmol／L NaCl培养液中3种多胺浓度均最大，之后多胺浓度随NaCl浓度升高而降低。在酸性（pH 5、6）培养液中多胺含量明显低于中性培养基，但在pH 8培养液中腐胺、亚精胺浓度最高，随后降低。结合DM菌在盐胁迫条件下的促生作用，其促生机制可能由于DM菌在盐胁迫条件下进行应激反应而产生3种多胺，所产生的多胺作为外源多胺进一步作用于植物，影响植物的生长发育，但其确切的分子机制，如多胺转运酶的变化，DM菌在胁迫条件下与多胺合成相关的机制需要进一步研究。