口腔鳞状细胞癌中ABCE1与RNase L的表达及意义

姜未来 毛立民 王海霞 刘乐天

口腔鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，占口腔颌面部恶性肿瘤的90%以上[1，2]，因此，寻找到与口腔鳞状细胞癌发生和发展相关的因子，并揭示出其参与肿瘤发生发展的分子机制尤为重要。三鳞酸腺苷结合转运子E1 蛋白（简称ABCE1）是ATP结合盒转运蛋白E 亚家族的成员之一，可与核糖核酸酶L（RNase L）特异性结合，抑制细胞内RNase L的活性[3，4]，进而阻断2-5A/RNase L 通路，该通路在降解肿瘤RNA、促进肿瘤细胞凋亡等方面都发挥着重要作用[5～7]，抑制该通路在一定程度上抑制了肿瘤细胞的凋亡。近年的研究表明：ABCE1 的异常表达与恶性肿瘤的增殖、转移有关[8，9]。因此，ABCE1 及RNase L 的表达量异常可作为判定肿瘤发生发展的重要指标之一。目前，这两种蛋白的表达在食管鳞癌[10]、肺癌[11]、膀胱癌[12]、前列腺癌[13]等肿瘤中的研究已有报道。本实验通过观察ABCE1 及RNase L 在口腔鳞状细胞癌中的表达，探究其表达异常与肿瘤发生发展的关系。

资料和方法

1.临床资料：取2016 年9 月～2018 年1 月哈尔滨医科大学附属第一医院病理科存档的口腔鳞癌组织蜡块60 例，患者年龄在44～77 岁，其中男性36例，女性24 例；发生于舌部23 例、牙龈11 例、口底8 例、颊部8 例、腭部7 例、唇部3 例；高分化25 例，中分化22 例，低分化13 例；无淋巴结转移的24 例，有淋巴结转移的36 例；所有患者均为原发肿瘤，术前均未行放疗、化疗及其他治疗等。正常口腔黏膜组织25 例，均取自阻生齿拔除术中切下的正常远中龈瓣组织，作为对照组。

2.试剂及仪器：兔抗人ABCE1 单克隆抗体（购自北京博奥森生物技术有限公司），鼠抗人RNase L 单克隆抗体（购自圣克鲁斯生物技术有限公司），PV-6001 试剂盒，PV-6002 试剂盒及DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。电烤箱、通风橱、显微镜等均由哈尔滨医科大学附属第一医院中心实验室提供。

3. 免疫组化染色：65℃烤箱中放入病理切片45min，二甲苯脱蜡30min，梯度酒精脱水5min×3次，水洗两遍，置入现配3% H202中10min，蒸馏水洗三遍，柠檬酸钠抗原修复，水洗两遍，PBS 冲洗5min×3 次，37℃山羊血清封闭液封闭30min。取出后滴加单克隆抗体ABCE1（1：50）、RNase L（1：200），4℃恒温过夜。次日，37℃复温45min，PBS 冲洗5min×3 次，滴加二抗，37℃30min,PBS 冲洗3min×3 次，DAB 显色，蒸馏水冲洗5min×2 次。苏木素复染，自来水冲洗5min×2 次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

4.结果判读：免疫组化检测的ABCE1 及RNase L 主要存在于口腔鳞癌细胞的细胞质中，以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。其表达程度按Sinicrop 的标准作为组织化学计分：H＝N×I。若H＞1 为阳性,H≤1 则为阴性。阳性细胞数百分率（N） 共分为5 个等级：＜5.0%；5.0%～25%；25%～50%；50%～75%；75%～100%。着色强度计分（I）：无染色为0 分；浅黄色为1 分；棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。

5.统计学处理：采用SPSS 22.0 统计软件，统计ABCE1 及RNase L 的表达率及相关临床信息，资料采取χ2检验，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。采用spearman 秩相关系数分析相关性，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.ABCE1 及RNase L 在口腔鳞癌及正常口腔黏膜组织中的表达：ABCE1 及RNase L 的表达主要集中于细胞质中，染色呈棕褐色。在口腔鳞状细胞癌中呈现高表达，在正常组织中表达极少或无表达（图1、2）。ABCE1 及RNase L 在口腔鳞状细胞癌中的表达量高于正常口腔黏膜组织（P＜0.05）（表1）。

表1 ABCE1 与RNase L 在口腔鳞癌（0SCC）及正常口腔黏膜组织中的表达

2.ABCE1、RNase L 的表达与口腔鳞癌临床病理因素分析：60 例口腔鳞癌患者中，ABCE1 及RNase L 的表达水平与性别、年龄、吸烟史无明显差异（P＞0.05）。而与分化程度及淋巴结转移相关（P＜0.05），（表2）。

图1 ABCE1 在口腔鳞癌 正常口腔黏膜中的表达（ ×200） 中的表达（ ×400）

图2 RNase L 在口腔鳞癌 正常口腔黏膜中的表达（ ×200） 中的表达（×400）

表2 ABCE1 与RNase L 表达与口腔鳞癌临床病理特征的关系

表3 ABCE1 和RNase L 在口腔鳞癌组织中表达的相关性

3.ABCE1 与RNase L 在口腔鳞状细胞癌中表达的相关性：采用Spearman 秩相关系数检验，结果显示60 例口腔鳞癌患者中，ABCE1 与RNase L 在口腔鳞癌中表达无明显相关性（P＞0.05），（表3）。

讨 论

ABCE1 最初被称为RNase L 抑制因子，可与RNase L 特异性结合，使RNase L 的活性降低，抑制了2-5A/RNase L 通路，使肿瘤细胞的转录、翻译失去控制，导致肿瘤的增殖分化能力显著增强[14]。口腔恶性肿瘤与正常组织有诸多不同，其中之一就是肿瘤组织具有局部侵袭和转移特性，而细胞骨架的异常改变已成为反映肿瘤细胞的这些恶性生物学行为的特征之一[15]。细胞骨架的改变使细胞形态及细胞粘附能力得以改变，与癌细胞的浸润、侵袭及迁移密切相关。β-肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，ABCE1 能与β-肌动蛋白相互作用导致细胞骨架的结构异常[16]进而影响细胞的形态、运动、及细胞内外的信息传递，从而增强了肿瘤细胞的侵袭、迁移能力[17]。细胞黏附因子是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质间黏附作用的细胞膜表面蛋白。E-cadherin 主要介导同型上皮细胞间的黏附，其异常也可导致细胞间的粘附力减低或丧失，有助于细胞的分离移动而获得转移潜能。此外，E-cadherin 的低表达还与肿瘤的分化及低的生存率有关[18，19]。而ABCE1 能特异性抑制E-cadherin 蛋白的表达，限制其发挥细胞间的粘附作用，促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移[20]。由此可见，ABCE1 在组织中的表达量增高对肿瘤的发生、侵袭及转移有促进作用。

RNase L 是一种在干扰素抗病毒作用过程中非常重要的核酸内切酶，近年来也被用于肿瘤方向的研究。RNase L 在2-5A/RNase L 途径中扮演着重要角色，哺乳动物细胞内存在无活性的RNase L，它的活化有赖于2-5A，而2-5A 的形成受2-5A 合成酶的调节，此酶可被肿瘤RNA 的激活，激活后的RNase L 可迅速降解病毒及肿瘤细胞转录翻译生成的RNA[21]。此外，活化的RNase L 亦可将完整的核糖体降解为不完整的形式，在一定程度上诱导病毒感染的细胞及肿瘤过度增殖的细胞凋亡，将病毒感染和肿瘤生长限制在一定区域内。因此，RNase L 在抗病毒、抗肿瘤，诱导细胞凋亡，调节RNA 稳定性及代谢方面都发挥着重要作用[22，23]。在肿瘤的发生及发展过程中也常常伴随着RNase L 含量的异常变化。

本次研究验证了在口腔恶性肿瘤中ABCE1 的表达量增加，高于正常口腔黏膜组织，肿瘤组织中的RNase L 的表达量高于正常组织。实验结果还说明口腔鳞癌中ABCE1 及RNase L 的含量与患者年龄、性别、吸烟史无明显关系（P＞0.05），而与肿瘤的分化程度及有无淋巴结转移有关（P＜0.05），且肿瘤的分化程度越低，二者的表达量越高。此外，实验发现在口腔癌中ABCE1 及RNase L 两者的表达量之间无明显关系，这可能与RNase L 蛋白的表达受2-5A 及ABCE1 的的双向调控有关，在肿瘤组织中RNase L 的活性虽然被ABCE1 部分抑制，但受RNA 的刺激2-5A 仍可活化RNase L 并促进其在细胞中表达量的增加。