华山新麦草易位系抗黄矮病的鉴定

吴 宽，牛永浩，康克功，赵 磊，吴云锋

(1.杨凌职业技术学院生物工程分院，陕西杨凌 712100; 2.西北农林科技大学植保学院，陕西杨凌 712100)

小麦是全世界最主要的粮食作物之一，在我国的种植面积居全球首位[1]。小麦黄矮病由大麦黄矮病毒(BYDV)与禾谷类黄矮病毒(CYDV)侵染引起，在世界范围影响小麦的产量和质量[2]。我国小麦黄矮病主要由BYDV危害引起。由于目前生产上缺乏优质抗病毒品种，防治该病的主要措施是喷施抗病毒剂和杀虫剂，通过控制病毒初侵染源和传毒介体蚜虫控制病害流行爆发[3]。为了持久控制该病害，培育和种植抗病品种是最经济有效的方法。大量研究表明，常规小麦品种一般不抗黄矮病。迄今为止，抗黄矮病的材料仅有中4、中5等[4]。本研究团队发现，华山新麦草(Psathyrostachyshuashanica)高抗黄矮病毒BYDV-GAV[5]。目前，对各种华山新麦草易位系的抗病性水平缺乏系统研究。为了明确各种华山新麦草易位系抗病性水平并在今后抗病育种中加以利用，本试验采用堆测法种植易位系材料，苗期接种饲毒蚜虫以传毒，对27份华山新麦草易位系材料进行抗病性鉴定，并运用RT-PCT技术半定量各种易位系植株体内病毒含量，为给优质抗BYDV新品种的选育提供重要种质资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为华山新麦草易位系27份，抗病小麦品种中5、感病小麦品种7182分别作为对照。BYDV-GAV、介体麦二叉蚜(Schizaphisgramimum)、质粒载体、菌株、酶等材料来源于西北农林科技大学分子植物病毒学实验室。Marker DL-2000由大连TaKaRa公司生产，冻存于 -80 ℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 无毒蚜虫的繁殖与毒源扩繁

介体麦二叉蚜在人工气候箱中繁殖，培养温度为22 ℃，光暗周期为14/10 h。毒源BYDV-GAV长期保存在人工气候箱内暗黑燕麦苗上，外罩纱网。毒源扩繁的方法：取3叶期的燕麦5～6盆，接饲毒2 d的带毒蚜虫到幼苗上，每株3～5头，繁殖毒源3 d，培养温度20 ℃，光暗周期为16/8 h。

1.2.2 材料播种、病毒接种与抗病性调查

采用堆测法(hill plot technique)[6]进行田间抗病性鉴定，2015-2017年在西北农林科技大学农一站进行。穴播，每穴点播5粒，每个处理播8穴，分为接种病毒畦和不接种病毒对照畦，重复3次。每年10月8日播种。在当年11月10日和次年返青期4月1日接种带毒蚜；接种10 d后叶面喷施2.5%高效氯氟氰菊酯水乳剂1 000倍稀释液灭蚜。接种后1个月调查发病株数与发病级别、株高、分蘖数，根据国际通用的黄矮病0～9级病情分级标准记录发病级别与株数[7]。分别测量每份材料的千粒重，计算千粒重(thousand kernel weight,TKW)的下降率。抗病性用病情指数来衡量，25以下为抗耐病(R)， 25～50为感病(S)，50以上为高感(HS)[7]。病情指数=∑(发病级别×相应各级病株数)/(调查总株数×10)×100，千粒重损失率=(未接种对照千粒重-接种千粒重)/未接种对照千粒重×100%。

1.2.3 植物总RNA提取、反转录及PCR扩增

参照文献[8-9]提取病叶总 RNA、反转录cDNA。参考文献[9]公布的陕西分离物GAV全基因组序列，设计CP基因特异性引物，正向引物为5′-ATGAATTCAGTAGGCCGTAGAAAT-3′，反向引物为5′-CTATTTGGGAGTCATGTTGGCAAC-3′，以25.0 μL反应体系进行PCR扩增[10]；用10%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,观察照相。GAV CP基因序列送到西安擎科泽西科技有限责任公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 供试材料的抗病性

应用堆测法田间播种试验材料，人工接种带毒蚜虫，结果(图1)表明，感病对照7182全部发病，病情指数为54.67；抗病对照中5零星单株表现症状，病情指数为0.73；华山新麦草易位系H9020-1-6-8-3等5份材料的病情指数介于 13.56～18.89，表明其对GAV表现抗性；H924-3-4 等9份材料的病情指数是介于 27.78～ 48.89，表现为感病；其余H9014-27-1-3-5-5等13份材料的病情指数均大于50.0，表现高感病性。

2.2 病毒侵染对株高、分蘖的影响

调查结果表明，冬前感染病毒的华山新麦草易位系幼苗株高降低率达到33.3%～66.6%，有效分蘖数减少50%。在拔节期～抽穗期感染病毒，感病华山新麦草易位系仅在旗叶或上部叶表现叶尖黄化症状。运用RT-PCT技术半定量法检测植株体内病毒含量，结果显示，被接种的华山新麦草易位系中均能检出GAV病毒，抗病毒易位系材料CP条带暗淡，说明病毒含量较低，而感病材料CP条带较明亮，说明叶片中病毒含量较高；接种区材料能检测到GAV，未接种区材料没有检测到病毒(图 2)。

图1 华山新麦草易位系抗黄矮病鉴定

2.3 病毒侵染对千粒重的影响

研究结果(表1)表明，华山新麦草易位系感染病毒后，造成千粒重不同程度的减少，其中，抗病性水平高的H9015-17-4-4、H9020-17-25-6-4千粒重损失率分别为5.31%、4.13%，高感材料H9014-14-4-6-1、H9014-154-2-15-3千粒重损失率分别为11.57%、11.31%。说明病毒侵染对抗病材料千粒重影响较小，对高感材料影响较大。

3 讨 论

小麦黄矮病抗病材料的筛选、鉴定是一项基础性工作，对抗病育种工作具有重要意义。钱幼亭等[7]、于祥泉等[3]通过对我国小麦品种和农家品种鉴定，获得了一些抗性品种。华山新麦草是我国华山山脉独有的珍稀物种，属于我国一级重点保护植物，是小麦近缘野生种质资源，具有很强的抗旱性、耐瘠薄、抗条锈病特性[11]。目前，有关我国通过细胞工程创制的华山新麦草易位系材料抗黄矮病的研究报道较少。本研究采用堆测法首次明确了华山新麦草易位系具有抗病、感病和高感类型，筛选到抗GAV的易位系H9020-1-6-8-3、H9020、H9020-17-3-5-6-4、H9020-20-12-1-8、H9015-17-4-4、H924-3-4。半定量分子检测结果显示，被检测易位系都受到了黄矮病毒GAV的侵染，但抗病的易位系叶片内病毒GAV病毒含量较低，而感病的易位系叶片内病毒含量较高。长期以来，除了发现的中4、中5品种等抗黄矮病外，国内外尚未寻找到优质的抗黄矮病资源[12]。筛选的华山新麦草易位系抗病材料可作为抗病毒种质资源在培育抗病毒新品种中加以利用，对该病在黄矮病流行区的防治将具有重要作用。

M：DM2000；1、7、8、16：未接种病毒的单株，依次为 7182、中5、H902 0-1-6-8-3、H9020-17-25-4-12; 2-6、9-15、17-28：接种病毒的单株，依次为 H9014-14-1-9-2、H9020-17-5、H9021-49-166-1、H921-11-10-10-10、H92-112、H9020-1-6-8-3、H9020、H9020-17-3-5-6-4、H9020-20-12-1-8、H9015-17-4-4、H924-3-4、H9020-17-25-4-12、7182、中5、H924-3-2、H9017-16-5-5、H8、H9020-17-3-5-6、H9、H9014-121-5-5-9、H9014-121-5-8-11、H9014-14-4-6-1、H9014-154-2-15-3、H9014-157-2-15-3。病毒CP基因条带：600 bp。

M:DM2000; 1,7,8 and 16:Non-inoculated virus plant,7182,Zhong 5,H902 0-1-6-8-3 and H9020-17-25-4-12; 2-6,9-15,and 17-28:Inoculated virus plant,H9014-14-1-9-2,H9020-17-5,H9021-49-166-1,H921-11-10-10-10,H92-112H9020-1-6-8-3,H9020,H9020-17-3-5-6-4,H9020-20-12-1-8,H9015-17-4-4,H924-3-4,H9020-17-25-4-12,7182,Zhong 5,H924-3-2,H9017-16-5-5,H8,H9020-17-3-5-6,H9,H9014-121-5-5-9,H9014-121-5-8-11,H9014-14-4-6-1,H9014-154-2-15-3 and H9014-157-2-15-3。CP gene band:600 bp.

图2 华山新麦草易位系单株中病毒CP相对含量的RT-PCR检测

Fig.2 RT-PCR detection of GAV CP inP.huashanicatranslocation lines

表1 病毒感染对千粒重的影响Table 1 Influence of virus infection on TKW

在进行华山新麦草易位系的黄矮病抗病性调查时，建议尽量在黄矮症状典型期进行发病株数与严重度调查。对于春季接种病毒，一般拔节期至扬花期症状开始出现，灌浆期症状表现明显，到乳熟期，由于光合营养逐步进入籽粒中，导致叶片普遍衰老黄化，从而掩盖了黄矮症状，容易造成调查结果数据偏大。本研究发现，病害调查时间在灌浆期进行比较合适，此时黄矮病症状特征明显，而生理性黄化尚未出现。更多相关研究还需进一步深入探索。