红叶石楠类胡萝卜素的提取与纯化及抗氧化活性初探

黄志伟，董子钰，范晓越，霍湘芸，蒋耀瑛，王岁楼

（中国药科大学 工学院，江苏 南京 211198）

红叶石楠是一种美丽的植物，叶子发芽后先红后绿，一般作为行道树养殖。在之前对红叶石楠功能性色素的研究基础上[1-3]，结合对香蕉皮中类胡萝卜素的研究[4-6]，并进行红叶石楠中类胡萝卜素提取与纯化方法的研究，旨在为红叶石楠综合利用及其功能性色素开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

材料与试剂：红叶石楠叶，2018年4月采于中国药科大学江宁校区；无水乙醇、丙酮、水杨酸、七水合硫酸亚铁、盐酸等，均为分析纯试剂。

仪器与设备：DFY-500型高速中药粉碎机、DZF-6050型真空干燥箱、TU-1810型紫外可见分光光度计、KH-100B型超声仪、RE-5205型旋转蒸发器、离心机、全温振荡培养箱。

1.2 红叶石楠预处理

石楠叶清洗，沥干水分，放入烘箱干燥24 h，取出后真空干燥2 h。研磨过筛（100目），得红叶石楠粉末试样。

1.3 类胡萝卜素提取

称取试样2 g，按一定料液比加入提取剂，在一定温度下超声提取一定时间。以转速5 000 r/min离心提取5 min，取上清液即为类胡萝卜素粗提液。

1.4 类胡萝卜素含量测定

于波长450 nm处测定粗提液的吸光度，根据标准曲线计算类胡萝卜素含量。

Y=0.073 6X+0.002 7.

式中：Y——吸光度；

X——提取量，μg/g。

1.5 单因素提取试验

提取溶剂选择：称取2 g红叶石楠粉末，分别加入石油醚、丙酮、乙酸乙酯、正己烷、丙酮∶石油醚 （3∶7， 4∶6， 5∶5， 6∶4， 7∶3） 作为提取剂，在料液比1∶30（g∶mL），温度40℃条件下超声提取40 min。

提取料液比选择：取4组样品，每组称取2 g红叶石楠粉末。以丙酮作为提取剂，在40℃下，分别以料液比 1∶10，1∶15， 1∶20，1∶30（g∶mL）超声提取40 min。

提取时间选择：取5组样品，每组称取2 g红叶石楠粉末。以丙酮作为提取剂，以料液比1∶20（g∶mL） 在40℃条件下超声提取20，30，40，50，60 min。

提取温度选择：取5组样品，每组称取2 g红叶石楠粉末。以丙酮作为提取剂，分别在30，40，50℃下超声提取40 min。

提取率计算：

1.6 正交试验优化提取工艺条件

采用L9（34）正交设计试验，确定最优提取方案。

红叶石楠类胡萝卜素提取正交试验因素与水平设计见表1。

表1 红叶石楠类胡萝卜素提取正交试验因素与水平设计

1.7 纯化试验方法

硅藻土活化，与洗脱剂进行湿法装柱，加入类胡萝卜素粗提液，用丙酮冲洗至液体无色，后用乙醇以一定的流速解析，得到纯化后的红叶石楠类胡萝卜素溶液，于波长450 nm处测定吸光度，计算纯化后溶液中类胡萝卜素的含量。

（1） 洗脱剂选择。以硅胶作吸附剂，上样量2 mL。分别用丙酮、丙酮/石油醚 （7∶3，6∶4，3∶7） 及石油醚，以1 mL/min流速洗脱，测定流出液的吸光度。

（2） 吸附剂选择。以丙酮∶石油醚7∶3作为洗脱剂，上样量1 mL，分别用硅胶、硅胶/硅藻土（1∶1，1∶3，3∶1） 及硅藻土作为吸附剂，以1 mL/min流速洗脱，测定流出液的吸光度。

（3） 上柱量选择。以丙酮/石油醚7∶3作为洗脱剂，硅胶/硅藻土1∶1作为吸附剂，分别加入0.5，1.0，1.5，2.0 mL的类胡萝卜素粗提取液，以流速1 mL/min的流速洗脱，测定流出液的吸光度。

纯化倍数计算：

1.8 类胡萝卜素抗氧化活性测定

参考文献[4]的方法，利用水杨酸法测定羟自由基清除率，评价红叶石楠提取液抗氧化活性。

式中A0——空白对照溶液吸光度；

AX——样品溶液吸光度；

AX0——不含过氧化氢的空白对照溶液吸光度。

2 结果与分析

2.1 提取试验结果

溶剂对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图1，料液比对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图2，提取时间对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图3，提取温度对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响见图4。

图1 溶剂对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响

图2 料液比对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响

图3 提取时间对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响

图4 提取温度对红叶石楠类胡萝卜素提取效果的影响

由图1～图4可知，不同的提取溶剂、料液比、提取温度和提取时间都对提取效果有明显的影响，最优提取条件初步可以确定为：以丙酮作提取剂，最佳料液比1∶15，最优提取温度30℃，最优提取时间50 min。

石楠叶类胡萝卜素提取的正交试验结果见表3。

表3 石楠叶类胡萝卜素提取的正交试验结果

通过极差分析可知，各因素影响次序为料液比＞提取时间＞提取剂＞提取温度；最优理论提取方案正好与正交试验中提取量最大的第9号试验条件组合一致为A3B3C2D1。因此，该试验最优提取条件确定为提取溶剂为丙酮，提取时间60 min，提取温度40℃，料液比1∶20（g∶mL），此时类胡萝卜素提取量为529.43 μg/g。

2.2 纯化试验结果

洗脱剂对红叶石楠类胡萝卜素纯化效果的影响见图5，吸附剂对红叶石楠类胡萝卜素纯化效果的影响见图6，上柱量对红叶石楠类胡萝卜素纯化效果的影响见图7。

由图5～图7可知，最佳洗脱剂为丙酮∶石油醚7∶3，最佳吸附剂为硅胶∶硅藻土为1∶1，最佳上样量为1.5 mL。经验证试验，按上述条件纯化后类胡萝卜素质量浓度47.94μg/mL（纯化前类胡萝卜素质量浓度26.47μg/mL），所以纯化倍数=47.94/26.47=1.81。

2.3 类胡萝卜素抗氧化试验结果

图5 洗脱剂对红叶石楠类胡萝卜素纯化效果的影响

图6 吸附剂对红叶石楠类胡萝卜素纯化效果的影响

图7 上柱量对红叶石楠类胡萝卜素纯化效果的影响

红叶石楠类胡萝卜素提取液及抗坏血酸清除率对比见图8。

图8 红叶石楠类胡萝卜素提取液及抗坏血酸清除率对比

由图8可知，当羟自由基清除率相同的情况下，所需要的红叶石楠提取液质量浓度低于抗坏血酸浓度，如果提高提取液的质量浓度，清除率也会大大提高，由此可知红叶石楠类胡萝卜素抗氧化能力较强。

3 结论

从石楠叶提取类胡萝卜素的最佳条件为提取溶剂为丙酮，提取时间60 min，提取温度40℃，料液比1∶20（g∶mL），提取率达0.052 9%。在室温下，以丙酮∶石油醚（7∶3） 为洗脱剂，硅胶∶硅藻土（1∶1） 为吸附剂，上样量为1.5 mL，粗提物可以初步纯化，纯化倍数为1.81。

红叶石楠类胡萝卜素具有较好的羟基自由基清除能力，作为天然食品抗氧化剂有一定的开发应用前景。