超高效液相色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中水杨酸的含量

胡 雪，张 悦，张立佳，莫 楠，段国霞，刘丽君，李翠枝*

（内蒙古伊利实业集团股份有限公司，内蒙古 呼和浩特 010110）

水杨酸是植物自身合成的一种天然小分子酚类化合物，主要调控植物的生长发育及果实成熟，并且作为植物的内源信号分子在抗逆反应中起关键作用[1]。水杨酸具有防腐、杀菌等作用，作为重要原料被广泛用于医药[2-3]、护肤品[4]、防腐剂[5]等领域，美国食品药品管理局、美国皮肤病学会规定，水杨酸作为非处方药使用的最高限量为2.0%；欧盟化妆品法规（EC）No.1223/2009附录V第3条款规定，水杨酸作为防腐剂的最大允许使用量为0.5%，作为非防腐剂，在淋洗类发用产品中的最大允许使用量为3.0%，在其他产品中的最大允许使用量为2.0%；中国国家食品药品质量监督管理局也规定，护肤品中水杨酸最高限量为2.0%。但我国在食品加工生产中禁止使用水杨酸，水杨酸为禁用食品添加剂，这是由于过敏体质人群食用水杨酸含量较高的食品后，会刺激食道和消化道黏膜，产生酸中毒症状，副作用严重，扰乱人体消化机能。调查显示，2.5%的欧洲人可能对水杨酸盐有过敏反应[6-7]。但是，水杨酸作为植物激素广泛存在于植物源性食品中，如蔬菜、水果、香草和香料等[8]。Morgan[9]认为，水果和蔬菜中存在的低含量天然水杨酸盐对人体有益。天然来源的水杨酸和人为添加的水杨酸的含量总和一旦超过一定范围就会引起过敏人群的过敏反应，而我国对食品中水杨酸含量的检测尚未出台相关的食品安全国家标准。食品行业迫切需要开发一种快速、通用、高效的检测方法，以便准确、及时地测定食品中水杨酸的含量。

目前，食品中水杨酸的测定方法有分光光度法[10]、高效液相色谱法[11-12]、气相色谱-质谱法[13-14]和液相色谱-质谱联用法[14]等，其中液相色谱-质谱联用法的灵敏度及特异性强，适合低含量检测。本研究聚焦于乳制品中水杨酸的含量测定，采用酸化乙腈溶剂提取，HLB柱净化，建立快速、准确的超高效液相色谱-串联质谱（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法，同时检测牛乳、酸乳、乳粉及冷冻饮品中水杨酸的含量。为企业风险控制提供科学依据，为国家标准的出台提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准物质：水杨酸（纯度99%） 捷世康生物科技有限公司；乙腈（色谱纯） 德国Meker公司；甲醇（色谱纯） 美国Fisher公司；磷酸（纯度＞99%）上海安谱实验科技股份有限公司；甲酸（色谱纯）沃尔孚科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-质谱联用仪（配备电喷雾离子源）、Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL） 美国Waters公司；3K30低温高速离心机 德国Sigma公司；KS 501涡旋混合振荡器 德国IKA公司；10430 Harris Oaks氮吹仪 瑞典Biotage公司；固相萃取装置 美国Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理

1.3.1.1 提取

称取试样2.0 g（乳粉样品称取0.5 g），放置于30 mL离心管中，加入5 mL水溶解试样，涡旋混匀；准确加入10 mL酸化乙腈（体积分数1%），涡旋混匀1 min，振荡提取10 min；加入2 g氯化钠，再振荡提取10 min，4 ℃条件下12 000 r/min离心10 min；分层后准确移取5 mL上清液于试管中，40 ℃氮吹至近干；加入0.2 mL甲醇复溶，涡旋混匀1 min，然后加入5 mL磷酸水溶液（0.02 mol/L），涡旋混匀30 s，超声波水浴助溶5 min，待净化。

1.3.1.2 净化

选用Oasis HLB固相萃取柱（60 mg/3 mL），依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.02 mol/L磷酸水溶液活化和平衡固相萃取柱，试管中液体全部上样，用0.02 mol/L磷酸水溶液润洗试管3 遍，每次涡旋30 s（每次1 mL），全部转移至固相萃取柱，待净化液流干后，先用3 mL磷酸水溶液（0.02 mol/L）淋洗固相萃取柱，弃去，再用3 mL水淋洗，弃去，最后用5 mL甲醇分2 次洗脱，收集洗脱液于10 mL专用氮吹试管中，洗脱液在40 ℃条件下氮气吹干，加入1 mL 20%甲醇水溶液复溶，过0.22 μm微孔滤膜后，供UPLC-MS/MS测定。

1.3.1.3 标准曲线的绘制

将质量浓度为100 ng/mL的标准中间溶液用20%甲醇水溶液稀释，稀释后质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 ng/mL，绘制标准曲线。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温35 ℃；进样量10 μL；流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈；流速300 μL/min；线性梯度洗脱条件如表1所示。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Procedure of gradient elution

1.3.3 质谱条件

电离模式：电喷雾离子源负离子模式；毛细管电压3.5 kV；源温110 ℃；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂气流量650 L/Hr；碰撞室气流量0.18 mL/min；多反应监测模式检测；其他质谱条件如表2所示。

表2 水杨酸的质谱测定条件Table 2 MS/MS conditions for salicylic acid

1.3.4 结果计算

试样中水杨酸的含量按下式计算。

式中：X为试样中水杨酸残留量/（μg/kg）；ρ为试样上机溶液中水杨酸残留量/（ng/mL）；V为样液最终定容体积/mL；n为稀释倍数；m为试样质量/g。

2 结果与分析

2.1 样品前处理条件优化

2.1.1 复溶溶剂的选择

比较磷酸-甲醇水溶液（8∶2，V/V）、20%甲醇水溶液、0.02 mol/L磷酸水溶液、0.02 mol/L盐酸水溶液和0.02 mol/L乙酸水溶液作为复溶溶剂的上柱洗脱效果，结果表明，0.02 mol/L磷酸水溶液洗脱效果最佳，回收率在85%左右，其他几种复溶溶剂的效果无明显差异，回收率均为70%～75%。水杨酸具有较强的酸性，磷酸-甲醇水溶液（8∶2，V/V）和20%甲醇水溶液无法将水杨酸完全复溶。此外，由于水杨酸微溶于水，磷酸增加其在水中溶解度的效果优于盐酸和乙酸。综上所述，本研究选择0.02 mol/L磷酸水溶液作为复溶溶剂。

2.1.2 净化方法的选择

分别选择Oasis MAX柱、Oasis HLB柱、Sep-Pak C18柱3 种净化柱，需要预先依次用3 mL甲醇、3 mL水、3 mL 0.02 mol/L磷酸水溶液活化和平衡固相萃取柱，直接对水杨酸加标量为20 μg/kg的空白样品提取液进行净化，外标法定量，比较回收率。结果表明：MAX小柱为混合型强阴离子交换柱，同时具有阴离子交换和反相保留能力，水杨酸在酸性条件下离子化被抑制，以分子状态存在，无法被吸附剂完全保留，回收率几乎为零；C18小柱效果一般，净化时间较长，回收率小于40%；HLB柱净化效果最好，回收率集中在80%～90%，整体在60%～120%范围内，满足方法要求，最终选择Oasis HLB柱作为净化柱。水杨酸的总离子流色谱图如图1所示。

图1 水杨酸的总离子流色谱图Fig. 1 Total ion current chromatogram for salicylic acid

2.2 标准曲线和定量限

表3 水杨酸的线性范围、线性方程、相关系数和定量限Table 3 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients and limits of quantitation of salicylic acid in milk and milk powder

按照1.3.2节的色谱条件，采用外标曲线定量法，以目标物的峰面积（y）对相应的质量浓度（x）作标准曲线。由表3可知，水杨酸质量浓度范围为0.5～50.0 μg/L时线性关系良好，标准曲线相关系数均大于0.999，方法对牛乳及乳粉中水杨酸的定量限分别为5.0、10.0 μg/kg，可以满足定量分析的需要。

2.3 方法回收率和精密度

表4 水杨酸测定回收率与相对标准偏差Table 4 Recovery and RSD

在阴性样品中添加5～40 μg/kg的水杨酸，各添加水平均做6 次平行实验，计算回收率和精密度。本研究测定定量限、2 倍定量限、4 倍定量限3 个不同添加量时的加标回收率。由表4可知，回收率范围为68.3%～111.7%，相对标准偏差范围为3.3%～15.2%，除乳粉基质加标回收率相对标准偏差大于10%以外，其余均小于10%。由于乳粉基质比酸乳、牛乳基质更复杂，基质干扰大，对定量限、2 倍定量限的相对标准偏差影响较大，但回收率在68.3%～111.7%之间，满足方法要求。以上数据说明，该方法具有较好的回收率和精密度。

2.4 实际样品检测

利用本研究建立的前处理和色谱、质谱条件对市场上销售的20 批次乳粉、20 批次牛乳、20 批次酸乳及20 批次雪糕中水杨酸的含量进行检测。结果表明，乳粉、牛乳、雪糕和原味酸乳中水杨酸均为未检出，与Kęszycka[8]、Swain[15]等的市场调查发现牛乳及原味酸乳中无水杨酸检出结果一致。而不同口味的酸乳中水杨酸含量有明显差异，草莓、黄桃、芒果和蓝莓口味的酸乳中均检测到水杨酸，添加草莓的酸乳中水杨酸含量略高，这与Scotter等[13]测得的草莓酸乳中水杨酸含量约为200 μg/kg结果相似，说明酸乳中添加的水果种类是造成水杨酸含量有所差异的主要原因。

3 结 论

采用UPLC-MS/MS同时测定牛乳、乳粉、酸乳及冷冻饮品中水杨酸的含量。该方法在水杨酸质量浓度0.5～50.0 ng/mL范围内具有良好的线性相关性，牛乳和乳粉中水杨酸的定量限分别为5.0、10.0 μg/kg，加标回收率在68.3%～111.7%之间，相对标准偏差在3.3%～15.2%之间。本方法简便、快速、回收率高、重现性好。本研究表明，不同水果口味的酸乳，天然水杨酸的含量低且差异很大，已有研究表明，果蔬中天然存在的水杨酸盐有利于人体健康，且果蔬中的少量水杨酸并不会引起过敏人群的强烈反应[6-7]。但水杨酸作为防腐剂、抑菌剂等添加剂添加到果蔬中会造成水杨酸含量升高，极有可能引起过敏人群的过敏反应。通过该方法可以准确、及时地测定食品中水杨酸的含量，为食品安全提供保障。