空间搭载长双歧杆菌BBMN68耐氧株筛选及其耐酸耐胆盐特性

隋馨瑶，孙二娜，王莹，赵亮,3，孙健，牛天骄，张明，文鹏程

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083；3.河北省畜产食品工程技术研究中心，河北 三河 065200；4.蒙牛高科乳制品(北京)有限责任公司，北京 101107；5.北京工商大学食品学院，北京 100048)

航天诱变技术就是利用返回式卫星搭载，将生物材料带入太空，在太空特殊的环境下，对种子进行多项诱变处理，改变种子的基因，从中筛选有益突变，获得新品种[1].近几年，我国已经开始利用航天诱变技术对微生物进行诱变，并得到了较理想的结果.在2007年，魏丽勤等[2]通过返回式卫星空间诱变的方法，对泰乐菌素的最终产量进行了空间诱变，发现弗氏链霉菌产泰乐菌素比出发菌株增加了74.6%[2].荆士华等[3]在2011年将生黑醋酸杆菌送入太空，利用空间搭载对该菌株进行诱变，经过筛选得到了一株高活性的生黑醋酸杆菌G454，该菌株在缩短发酵周期的同时，提高了7.68%山梨糖产率[3].在2014年李雄超等[4]将干酪乳杆菌G5搭载“神舟八号”飞船进进入太空，进行航天诱变，诱变后的菌株经过筛选，获得了2株高产胞外多糖的乳酸菌，其菌株胞外多糖的产量分别较对照提高1.9倍和1.7倍[4].

早在1899年，法国学者Tissier从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到了双歧杆菌(Bifidobacterium)，该菌株形态不一，无芽孢，呈现革兰氏阳性，是一种厌氧型杆菌[5].经过多位学者研究发现，该菌株在人体消化系统中有益生作用，可以促进人体发育，提高人体免疫力，减缓衰老，同时在抗肿瘤方面也充当重要角色[6-11].目前，在人体健康方面，双歧杆菌已成为重要指标之一[12].双歧杆菌属于专性厌氧菌，具有独特的果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶，严格厌氧[13]，在加工、包装和贮藏过程中活力降低，在应用及贮存过程中接触氧气会严重威胁其存活及益生功能的发挥.因此，如何提高双歧杆菌的耐氧性是促进其广泛应用的关键问题.

本研究选用的长双歧杆菌BBMN68来源于健康长寿老人肠道，研究表明BBMN68具有调节免疫[14-15]、改善肠道消化功能、改善便秘、增强机体免疫及抗衰老的作用[16-20]，是优良的益生菌.2016年10月，长双歧杆菌BBMN68搭载“神舟十一号”飞船经过33 d太空诱变后返回.本研究以长双歧杆菌BBMN68为出发菌株，利用航天诱变技术对其进行诱变处理，以期获得高产酸的突变株，并对筛选到的突变株进行生长情况、形态及耐受性评价，为菌株应用提供基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株及空间搭载 本试验采用的出发菌株为长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)BBMN68，此菌株是本实验室从广西巴马长寿老人的粪便中分离筛选得到的，经研究，该菌株具有良好的益生功能.现菌株保存在中国农业大学教育部功能乳品重点实验室.本试验将长双歧杆菌BBMN68冻干粉置于无菌搭载小管中，搭载前4 ℃保存.“神舟十一号”返回式飞船2016年10月17日发射，2016年11月18日返回地面，飞行过程中样品置于飞船返回舱，返回地面后取出样品，4 ℃冰箱保存备用.

1.1.2 培养基 MRS液体培养基：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，酵母浸粉5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，无水乙酸钠5 g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.58 g，硫酸锰(MnSO4·H2O)0.2 g，吐温-80 1 mL，蒸馏水1 L，调节pH至6.5.

MRSC液体培养基：MRS液体培养基中每升添加半胱氨酸0.5 g.

MRSC固体液体培养基：培养基成分同液体培养基，每升添加琼脂15 g。

MRSC耐胆盐培养基：MRSC液体培养基中胆盐含量根据试验要求添加.

保护剂：12%脱脂乳中加入30%甘油.

所有培养基均121 ℃灭菌15min.

1.1.3 主要仪器及设备 WFZ UV-2102PC型紫外可见分光光度计：上海Unico 公司；DNP-9082型电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；XSZ-4G显微镜：COIC公司；TGL-16B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；LDZM立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DK-98-II2KW洁净工作台：天津泰斯特仪器公司；DELTA320 pH计：METTLER-TOELDO公司；T100 PCR仪：美国伯乐公司.

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离与鉴定 将MRSC液体培养基分装于厌氧管中，每管10 mL，向其充入氮气，使管中形成无氧条件，经121 ℃灭菌15 min后备用.将航天诱变后菌粉接种于所述的pH 6.5的MRSC液体培养基中，在37 ℃培养12 h 后，将菌液进行10倍梯度稀释，稀释液均匀涂布于固体平板，将平板倒置于装有厌氧产气袋的厌氧盒中，将其放入37 ℃恒温培养箱，培养48 h，从固体平板上挑取单菌落30个接种液体试管培养12 h后，进行革兰氏染色和镜检，观察菌体颜色、大小、分叉形状等是否符合双歧杆菌属的基本形态特征.按参考文献[21]的方法提取菌株基因组DNA，并进行16S rDNA基因序列分析以确定菌株纯度.

1.2.2 菌株保藏 经过鉴定后，确定为长双歧杆菌的菌株，将其接种在新鲜的pH 6.5的MRSC液体培养基中，将其放入37 ℃恒温培养箱中，培养12 h左右，将培养后的菌液在超净工作台中进行转移，将其转移至10 mL离心管中进行离心10 min(4 200～4 500 r/min)，弃去上清液，加入保护剂2 mL，充分混匀，用移液枪吸取1 mL分装于1.5 mL离心管中，于-20 ℃中保存[22].

1.2.3 耐氧菌株的筛选 将经过鉴定的菌株与野生株BBMN68接种、活化2代后，按1%接种量分别接种于pH6.5的MRS和MRSC液体培养基中，在37 ℃培养箱培养16 h后，用紫外可见分光光度计分别测定不同培养条件下的菌悬液的光密度值D600nm，并计算有氧条件与无氧条件下D600nm的比值.进行稳定重复试验，传10代后，与野生株耐氧能力进行比较，得到耐氧能力显著高于野生株且稳定性较好的突变株[23].

1.2.4 生长曲线的测定 将突变株与原始菌株BBMN68接种、活化2代后，按1%接种量分别接种于pH6.5的MRSC厌氧培养基中，将其放入37 ℃恒温培养箱连续培养24 h，在培养过程中，每隔2 h用紫外分光光度计测定菌悬液的光密度值D600nm，绘制D600nm光密度值对培养时间的生长曲线[24].

1.2.5 透射电镜分析 将突变株与原始菌株BBM N68接种、活化后，分别等量接种于pH值为6.5的MRSC培养基中，在厌氧条件下37 ℃连续培养12 h后，进行下面透射电镜样品处理：

1)取样：取培养后的样品离心(转速3 000～4 000 r/min)，弃去上清液，收集菌体，并用pH(7.2～7.4)的0.1 mol/L PBS清洗菌体3遍；清洗时菌体温柔悬浮.

2)固定：将上述得到的菌体用2.5%戊二醛固定3 h，并用PBS清洗2遍，每遍10 min，再用纯水清洗2遍.

3) 电镜观察：将固定后的菌体进行透射电镜TecnaiG2F20S-TWIN(200KV) 观察.

1.2.6 菌株耐酸能力的测定 参考Patel的方法[25].将活化好的菌株以2%的比例接种于pH值为6.5的MRSC培养基中，在厌氧条件下37 ℃连续培养15 h后，分别以2%的接种量接种于pH值为4.0、3.5和3.0的MRSC培养基中.37 ℃下分别培养0、2、4 h，对突变菌株与原始菌株进行平板计数，计算菌株致死率.每组试验至少有3个重复.

1.2.7 菌株耐胆盐能力的测定 参考Patel的试验方法[25].将待测菌株接种、活化后，按2%接种量分别接种于pH6.5的MRSC培养基中，在厌氧条件下37 ℃连续培养15 h后，分别以2%的接种量接种于含0.1%、0.2%、0.3%胆盐的MRSC胆盐培养基中.37 ℃下分别培养0、1、2、3、4 h，对突变菌株与原始菌株进行平板计数.

1.2.8 数据统计与分析 采用Excel 2016和SPSS 19.0处理数据，运用ANOVA进行统计学分析，平均值和标准差均由3个重复值所得.单因素方差检验采用Duncan’s新复极差法检测，显著水平α=0.05.

2 结果与分析

2.1 菌株分离与鉴定结果

根据1.2.1所描述的方法进行了菌株的分离与鉴定.经电子显微镜观察发现，所挑取菌种的菌体形状多数呈现棍棒状，分叉 Y形棒状.将这些菌株进行DNA提取，并进行16S rDNA基因的PCR扩增，将PCR产物纯化后委托上海生工生物技术有限公司测序，得到了16个菌株，将测序结果在NCBI 网站上应用BLAST 软件在基因库中进行同源性比对.结果显示，16株的16S rDNA PCR扩增产物的核心序列与长双歧杆菌BBMN68的基因序列一致，因此鉴定为长双歧杆菌.

2.2 耐氧菌株的筛选

由表1有氧无氧的光密度比值可知，16株菌株中，8株耐氧能力较野生株显著下降，6株耐氧能力与野生株无差异，只有2株耐氧能力比野生株略高，即比值最高的2个菌株，分别为B-3-3和B-4-3.进行稳定性重复试验，传10代后，与野生株耐氧能力进行比较，结果见表2.由表2可以看出，经过10代后，有氧D600nm/厌氧D600nm比值只有B-4-3耐氧能力显著高于野生株，说明经过航天诱变的菌株耐氧能力比野生株有一定的提高且具有一定的遗传稳定性.

表1 长双歧杆菌BBMN68在有氧与无氧条件下的生长情况

同列相同字母表示不同菌株间无显著性差异，同列不同字母表示不同菌株间有显著性差异(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

表2 突变株与野生株BBMN68耐氧能力比较

每列相同字母表示不同菌株间无显著性差异；每列不同字母表示不同菌株间有显著性差异(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.3 耐氧菌株的生长曲线

为了解突变株的生长情况，测定了在600 nm处突变株与野生株2 4h的D值，结果见图1.0～12 hD值不断提高，16 h时达到对数稳定期，此后曲线趋于平缓，经统计分析B-4-3突变株在厌氧条件下的生长情况基本与野生株保持一致，表明了其在耐氧性提高的同时，其原有生长特性也没有改变.

图1 野生株BBMN68与突变株B-4-3 24 h生长曲线Figure 1 Growth curve of wild-type strain BBMN68 and mutant strain B-4-3 for 24 h

2.4 耐氧菌株电镜结果

野生株和突变株的形态比较见图2.图2-A为野生株，其形态呈弯曲棒状，边缘较整齐；图2-B为突变株，其形态与野生株无差异，说明航天诱变并没有改变菌株形态.

2.5 耐氧菌株耐酸能力评价

根据1.2.6的方法对野生株和突变株的耐酸能力进行比较，结果见表3.在不同 pH值的培养液中，双歧杆菌活菌数随 pH值的降低数量减少，双歧杆菌在低 pH值条件下生长受到抑制，其原因可能在于酸性环境使糖代谢关键酶(6-磷酸果糖激酶)受到了反馈抑制，使双歧杆菌的代谢受到了抑制，减少了细胞构建所需能量和物质提供，从而阻遏了菌体生长以及存活[26].此外，在pH值4.0培养2 h与4 h，突变株较野生株的存活率显著升高，而在pH 3.5与pH 3.0条件下，突变株与野生株各时间存活率并无明显差异，且存活率较低，说明突变株维持了良好的耐酸能力.

图2 长双歧杆菌BBMN68野生株(A)与突变株(B)形态Figure 2 Bifidobacterium longum BBMN68 wild strain (A) and mutant strain (B)

表3 耐氧菌株耐酸能力评价

同列相同字母表示不同菌株间无显著性差异；同列不同字母表示不同菌株间有显著性差异(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

2.6 耐氧菌株耐胆盐能力评价

野生株和突变株的耐胆盐能力比较结果见表4.在不同胆盐浓度的培养液中，双歧杆菌活菌数随 胆盐浓度值的升高数量减少，双歧杆菌在高胆盐浓度条件下生长受到抑制.0.1%胆盐条件下培养2 h，野生株的存活率为62%左右，而突变株的存活率达到71%左右，比野生株提高了10%，当培养时间达到4 h后，突变株与野生株存活率基本相同，且存活率保持在50%左右；与0.1%胆盐含量相比，在0.2%与0.3%胆盐含量的培养条件下，突变株与野生株的存活率均明显下降，说明胆盐对于长双歧杆菌BBMN68的生长有抑制作用.在胆盐环境培养4 h过程中，突变株与野生株的存活率无显著性差异，说明航天诱变没有降低长双歧杆菌对胆盐的耐受能力.

表4 耐氧菌株耐胆盐能力评价

同列相同字母表示不同菌株间无显著性差异，同列不同字母表示不同菌株间有显著性差异(P<0.05).

The same letters in the same column indicate no significant difference,the different letters indicate significant difference(P<0.05).

3 讨论

航天诱变技术具有很多优点，可以进行多方面诱变，并且诱变率较高.本次试验采用的菌株为长双歧杆菌BBMN68，将其进行航天诱变后，菌株的耐氧能力发生了较大的变化.结果显示，突变株B-4-3耐氧能力显著高于野生株，耐氧能力提高20%左右.本次试验将筛选得到的突变菌株连续传代10次，突变菌株B-4-3耐氧能力在传代1～10次间无显著性差异，具有稳定的遗传性.

乳酸菌在工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都不可避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，如在发酵生产过程中随着乳酸的积累导致的酸胁迫、制剂化过程中的冷冻胁迫、在人体胃肠道系统中所经历的胃酸和胆盐胁迫等，这些胁迫严重影响了乳酸菌的生长、代谢及生理功能，从而影响了益生功能的发挥.因此，如何提高乳酸菌对各种环境胁迫的抗性，成为了学术界和产业界共同关注的焦点.本试验对菌株的耐酸能力进行评价，突变株与野生株各时间存活率并无明显差异，且存活率较低，说明突变株维持了良好的耐酸能力.

胆汁酸在肝脏合成，并与牛磺酸和甘氨酸结合形成胆盐，广泛存在于哺乳动物和其他脊椎动物体内[27].在人体中，胆盐的主要生理功能是作为生物乳化剂，乳化食物中的脂肪，促进脂肪的消化吸收.磷脂双分子层结构是微生物细胞膜的骨架，胆盐可以破坏脂质结构进而造成微生物细胞泄露甚至细胞死亡[28]，因此胆盐是人体对抗外来有害微生物的重要生理屏障.然而胆盐的这一生理功能也为口服益生菌产品的有效性带来了负面影响，耐受宿主消化道的胆盐成为益生菌筛选的必要前提条件.在现有的文献报道中，已有大量关于乳酸菌对胆盐耐受机理的研究.其中，菌体表面疏水性[29]、菌体抗氧化能力[30]、胆盐水解酶活性、胆盐环境中的细胞完整性[31]是相关研究关注的主要生理指标，菌体胆盐耐受能力的变化，引起了相关生理指标的变化.本文中耐胆盐试验旨在证明航天诱变没有降低长双岐杆菌对胆盐的耐受能力.

本研究是利用空间搭载对长双岐杆菌BBMN68进行诱变，改变其菌株的耐氧能力.本研究的突出点正是利用了这种新型的诱变技术，但其中也有不足之处，航天诱变并不能确保其某一特性变化的同时，保持其他性质不变.原因在于航天诱变是利用太空特殊的环境使菌株产生突变，主要是通过强辐射、微重力、高真空等太空综合环境因素诱发变异.航天诱变对含有益生菌的新型发酵乳制品的研制，似乎是一种有趣的方法.

4 结论

通过航天诱变共分离出16株突变菌株，获得1株耐氧性能较好的菌株，在MRS不充氮气的厌氧管中可以正常生长且具有一定的稳定性，与野生株耐氧能力相比，一株突变株耐氧能力显著提高.经16S rDNA测序，鉴定该菌株仍为长双歧杆菌BBMN68.双歧杆菌活菌数随 pH值的降低数量减少，在较高pH值条件下，突变株较野生株的存活率显著升高，在较低pH值条件下，突变株与野生株各时间存活率并无明显差异；突变杆菌活菌数随胆盐浓度值的升高数量减少.耐受性试验说明突变株在增加了耐氧能力的同时，仍基本保持了菌株原有的其他方面性能.本研究结果为益生菌BBMN68的广泛应用奠定了基础.