响应面法优化太空茄子叶总黄酮的提取工艺

杨彬，金小青，李彩霞，焦扬

(1.河西学院农业与生物技术学院，甘肃 张掖 734000；2.甘肃省高校河西走廊特色资源利用省级重点实验室，甘肃 张掖 734000)

茄子(SolanummelongenaL.)为茄科茄属，别名落苏、酪酥、昆仑瓜等，是为数不多的紫色蔬菜之一，也是一味中药[1].茄子种植广泛，价格低廉，取材容易，其花、果、茎、叶、根均可药用，无毒、甘寒、具有活血散癖、消肿止痛、宽肠理气之功效[2].太空茄子通过太空诱变及日光温室加代选育后，再经杂交选育，形成了具备高产、抗病性强、营养成分高等特点的新品种.而茄叶为茄子采收过程中下脚料之一，主要作为肥料或废料处理，附加值较低.茄叶中富含多糖、龙葵碱、茄尼醇、咖啡酸、黄酮、挥发油、多酚等多种有效成分[3-7].黄酮作为茄叶中主要成分之一，具有抗炎、抗肿瘤、抗凝血、抑菌、防止心血管疾病、调节激素、防护、抗氧化、抗衰老作用[8-12]，因而具有较高的药理及保健开发价值，已成为医药、食品领域的研究热点.

周宝利等[13]采用有机溶剂提取茄子中总黄酮，并对不同品种黄酮含量进行了测定；李睿等[14]采用微波辅助提取茄子根中总黄酮；王治业等[15]对茄子皮中总黄酮提取工艺进行了优化；安红钢等[16]对茄蒂中黄酮含量进行测定并分析其对自由基的清除效果的影响；莫天录等[17]对绿茄叶黄酮的纯化工艺进行了研究.综上所述，目前茄子的副产品研究主要局限于茄子不同部位的研究，而关于太空茄子叶总黄酮方面的研究尚未见报道，为提高太空茄子采摘后的茄叶的附加值，对其黄酮提取工艺进行分析，提高资源利用价值.本试验以太空茄子叶为研究材料，采用单因素和响应面试验优化太空茄子叶中总黄酮的提取工艺条件，利用HPLC确定其总黄酮的单体组成，为试材的进一步研究和开发提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试材：太空茄子叶采摘于河西学院农业试验园.

试剂：C2H5OH、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、Na2CO3等药品为国产分析纯；C2H3N、CH3OH、H3PO4为国产色谱纯.芦丁标准品(批号：100080-201610)、阿魏酸标准品(批号：110773-201012)、槲皮素标准品(批号：100081-200907)均购自北京世纪奥科生物技术有限公司.

1.2 仪器与设备

河南省巩义市英峪予华仪器厂生产的SHZ-2000型双配套循环水式多用真空泵；上海棱光技术有限公司生产的Spectrμmlab24分光光度计；国华电器有限公司生产的HH-4数显恒温水浴锅；AL204 Mettler Toledo公司生产的分析电子天平；美国PerkinElmer公司生产的2000Autosampler高效液相色谱仪.

1.3 试验方法

1.3.1 太空茄子叶的处理 茄子叶片清洗，阴干粉碎(60目)后利用石油醚(料液比1∶5)回流2.5 h，除去茄叶中的色素等物质后，风干备用.

1.3.2 太空茄子叶黄酮的提取

1.3.2.1 总黄酮提取 称取0.5 g处理后的太空茄子叶粉末置于100 mL蒸馏瓶，不同料液比环境中，加入不同体积分数的乙醇，设置不同的温度、时间回流提取，冷却后真空抽滤，取滤液置于50 mL容量瓶，并用对应体积分数的乙醇定容，根据标准曲线测定总黄酮含量.

1.3.2.2 单因素试验 准确称取样品0.50 g，在提取温度为80 ℃、料液比1∶40(g/mL)加入体积分数70%的乙醇溶液、提取1.5 h的条件下，固定其他条件不变，各因素的水平梯度设置分别为提取时间1、1.5、2、2.5 h；料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70(g/mL)；提取温度60、70、80、90 ℃；乙醇体积分数50%、60%、70%、80%、90%；以总黄酮得率为指标，进行单因素试验，每个试验重复3次.

1.3.2.3 太空茄子叶黄酮提取条件试验设计 在其他条件固定的试验设置下，分别研究提取时间(X1)、料液比(X2)、乙醇体积分数(X3)对太空茄子叶黄酮提取效果的影响.单因素试验，用Design Expert 8.0软件设计Box-Behnken试验，试验设计见表1.

1.3.3 标曲绘制和黄酮得率计算

1.3.3.1 测定波长 将芦丁标准液与稀释30倍的回流提取液各0.5 mL、加0.3 mL 5%亚硝酸钠混匀后反应6 min、继续加0.3 mL 10%硝酸铝反应6 min、再加入4.00 mL 4%氢氧化钠显色之后，用30%的乙醇定容至10 mL，在400～600 nm下得到黄酮的最大吸收波长.

表1 试验因素与水平设计

1.3.3.2 芦丁标准曲线的绘制 标准曲线的制作参照高海宁等[18]的方法.称取芦丁20.0 mg，用少量75%乙醇溶解后移至100 mL容量瓶并定容，得到质量浓度为0.2 mg/mL芦丁标准品，冷藏备用.取芦丁标准溶液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，分别置于10 mL容量瓶，加0.3 mL 5%亚硝酸纳溶液摇匀后静置6 min，然后加0.3 mL 10%硝酸铝溶液摇匀后静置6 min，再加入4.00 mL 4%氢氧化钠，用30%的乙醇定容至刻度摇匀后静置15 min.以空白试剂为对照，508 nm波长处测定吸光度.以吸光度为纵坐标，芦丁质量为横坐标作标准曲线，得出回归方程y=0.902 4x+0.005 4，R2=0.999 6.

1.3.3.3 太空茄子叶黄酮得率计算 按1.3.1.1方法提取太空茄子叶总黄酮，准确吸取一定体积的滤液，按绘制标准曲线的方法，测定吸光度，根据回归方程，求总黄酮得率.

式中，50是定容后滤液体积(mL)；v为加入反应体系中的滤液体积(mL)；m为处理后称取的茄叶粉末质量(mg).

1.4 提取液中黄酮的定性鉴定

1.4.1 显色反应 取适量的样品溶液，分别与氢氧化钠溶液、硼酸溶液、三氯化铁、乙酸镁、盐酸-镁粉、三氯化铝反应，观察颜色变化，并紫外灯照射，观察荧光反应.

1.4.2 液相色谱条件 色谱柱：Hypersil ODS2分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm).流动相：A为乙腈溶液，B为0.1%的磷酸溶液，梯度洗脱程序为：0～10 min，10%的乙腈；10～30 min，10%～30%的乙腈；30～60 min，30%～40%的乙腈；60～90 min，40%～70%的乙腈；90～130 min，70%～90%的乙腈；进样量为10 μL，检测波长326 nm.以标准样品保留时间和样品比较，确定样品中存在的黄酮类成分.

1.5 数据处理

采用Excel 2003数据处理，Origin 7.5软件进行作图，图中数据均为3次数据的平均值加标准误差，采用Design Expert 8.0软件(ANOVA)进行方差分析.

2 结果与分析

2.1 总黄酮的测定波长

芦丁标准液与太空茄子叶提取液显色后在400～600 nm可见光区域扫描.结果表明，标样和样液的最大吸收峰都在508 nm处，因此选择508 nm作为太空茄子叶黄酮测定波长.

2.2 单因素试验

2.2.1 提取时间对总黄酮得率的影响 提取时间对太空茄子叶总黄酮得率的影响如图1所示.太空茄子叶总黄酮得率随提取时间的延长呈现先升高后降低的趋势，提取时间为1.5 h，总黄酮得率为最大值.由Fick扩散定律可知[19]，在一定时间内，总黄酮得率与提取时间呈正相关；当提取时间过长时，太空茄子叶中其他成分溶出量增多，导致总黄酮得率下降.因此，确定提取时间为1.5 h作为响应面试验的中心点.

图1 提取时间对总黄酮得率的影响Figure 1 Effects of time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 料液比对总黄酮得率的影响 液比对太空茄叶总黄酮得率的影响见图2.在其他条件不变的前提下，随料液比的增大，总黄酮得率相应升高，料液比为1∶40(g/mL)时，总黄酮得率最高；由于细胞内和提取溶剂之间浓度梯度增加，传质效果增加[20]，得率不断增加；当料液比超过1∶40(g/mL)时，总黄酮得率下降；可能是由于太空茄叶中其他杂质成分的溶解性增加，导致得率下降；因此，选择料液比为1∶40(g/mL)为后续响应面试验的中心点.

图2 料液比对总黄酮得率的影响Figure 2 Effects of solid-to-liquid ratios on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 提取温度对总黄酮得率的影响 由图3可知，总黄酮得率随温度的升高而升高，当温度高于80 ℃时，总黄酮得率上升趋势比较缓慢，原因可能是温度升高时，细胞间的碰撞加速使细胞破裂，总黄酮溶解速度加快；但总黄酮在较高温度下，由于其稳定性较差[21]，使其结构发生破坏，从而影响其得率；当提取温度为80 ℃时，与提取温度为90 ℃二者得率进行比较，二者差异不显著(P<0.05)，从节约能耗角度考虑，选择80 ℃为提取最佳温度.

图3 提取温度对总黄酮得率的影响Figure 3 Effects of temperatures on extraction yield of total flavonoids

2.2.4 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响 由图4可知，随乙醇体积分数增加，太空茄子叶总黄酮得率呈现先升高后降低的趋势，乙醇体积分数为80%时，太空茄子叶总黄酮得率最高.可能是随乙醇溶液体积分数增加，总黄酮极性和一定体积分数的乙醇极性相似；乙醇体积分数过大时，茄子叶中醇溶性杂质大量溶出，影响总黄酮溶出效果，导致总黄酮类物质得率降低.因此，确定以80%体积分数的乙醇为后续响应面试验的中心点.

图4 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响Figure 4 Effects of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

2.3 黄酮类化合物提取工艺回归模型的建立及响应面分析

2.3.1 回归方程的建立 单因素试验，对影响太空茄子叶中总黄酮得率的主要因素提取时间、乙醇体积分数和料液比采用BB试验设计，试验结果见表2.

用Design Expert 8.0软件对表2试验数据统计分析，得到太空茄子叶中总黄酮类化合物的提取率(Y)与提取时间(A)、料液比(B)和乙醇体积分数(C)各因素变量之间的函数关系：

Y=9.56+0.30A+0.18X2-0.39C-0.075AB-0.039AC-0.055BC+0.18A2-0.59B2- 1.08C2

为说明回归方程的有效性以及各因素对总黄酮得率的影响程度，对回归方程进行方差分析，结果见表3.

从表3可以看出，模型P=0.002<0.01，说明此模型极显著；失拟项P=0.111 6>0.05，不显著，拟合程度较好.R2=0.936，说明93.6%可用此模型来解释各因素与总黄酮得率之间的关系.C(乙醇体积分数)、C2(乙醇体积分数二次项)、B2(料液比二次项)对太空茄子叶总黄酮得率达到极显著水平；A(提取时间)对总黄酮类化合物提取率影响差异显著(P<0.05)，其他项影响不显著(P>0.05).

表2 响应面试验设计及结果

表3 响应面方差分析二次模型方差分析表(部分平方和- Ⅲ型)

**差异极显著P<0.01;*差异显著P<0.05.

**P<0.01；*P<0.05.

由F值表明，各因素对太空茄子叶总黄酮得率的影响顺序由大到小依次为：乙醇体积分数>提取时间>料液比.

2.3.2 响应面分析与优化 从图5分析可以看出，各因素的效应值随着自变量(试验因素)的变化为：随着提取时间的单独延长，得率的变化趋势是缓慢增加，其曲线较平缓，说明提取时间对响应值影响不显著；随着料液比的单独增加，提取率变化趋势是先增加后下降，其曲线倾斜度大，表明料液比对响应值影响显著；随着乙醇体积分数的增大，提取率的变化趋势是先增加后迅速下降，其曲线倾斜度较大，说明乙醇体积分数对总黄酮的提取率影响较大，对响应值影响较大.

从图6-A可以看出，固定乙醇体积分数，随着提取时间的延长，总黄酮得率先急剧增大，其变化曲度较陡峭，说明该因素对总黄酮提取影响较大，从响应面和等高线可以看出，在提取时间为1.8 h时，料液比为1∶40时黄酮提取率最高.

图5 单因素效应与总黄酮提取率的关系图Figure 5 Relations between single factor effect and total flavonoids extraction yield

从图6-B可以看出，当提取时间一定时，随乙醇体积分数的增大，太空茄子叶中总黄酮得率先缓慢升高后迅速降低，其变化曲度较大；当乙醇体积分数一定时，随提取时间延长，总黄酮的提取率逐渐升高.从响应面图可知，提取时间为1.8 h时，乙醇体积分数80%时总黄酮提取率最高.

由图6-C可知，随料液比的升高，太空茄子叶中总黄酮得率先缓慢升高，后缓慢降低；相比而言，较乙醇体积分数的变化趋势较大，说明对总黄酮得率的影响较大.从响应面和等高线可以看出，当料液比为1∶40时，乙醇体积分数80%总黄酮得率有最高响应值.

图6 逐因素交互作用对总黄酮得率的影响Figure 6 Effects of each eactor interaction on extraction yield of total flavonoids

2.3.3 最佳工艺条件的预测和检验 通过二次多项回归的预测，得出太空茄子叶总黄酮提取的最佳条件为提取时间1.830 h、料液比1∶42.23(g∶mL)、提取温度80 ℃、乙醇体积分数78%，此时的太空茄子叶总黄酮得率预测值为9.87%.结合现实的操作过程和便捷性，将其提取工艺参数修正为：提取时间1.8 h、料液比1∶42(g∶mL)、提取温度80 ℃、乙醇体积分数78%，、测定得到总黄酮得率为9.82%.说明建立的模型与实际情况基本吻合.

2.4 提取液中黄酮的定性鉴定

2.4.1 颜色反应 由表4可知，太空茄子叶黄酮提取液中确定含有黄酮类化合物，如黄酮醇，查尔酮异黄酮等.

表4 颜色反应试验结果

2.4.2 液相色谱 由图7可知，在10.19 min出峰的是芦丁标准品；在11.27 min出峰的是阿魏酸标准品；在15.37 min出峰的是槲皮素标准品；在19.36 min出峰的是山奈酚标准品.由图7与图8对比可知，太空茄子叶黄酮中含有芦丁、阿魏酸和槲皮素.此结论与罗慧玉等[22]采用HPLC确定杏花中阿魏酸、芦丁和异槲皮苷方法一致.

图7 黄酮标准品在326 nm 处的HPLC液相色谱图Figure 7 HPLC chromatogram of favonoids standardd at 326 nm

图8 太空茄叶总黄酮提取液在326 nm 处的HPLC 液相色谱图Figure 8 HPLC chromatogram of favonoids extracts from space eggplant leaf at 326 nm

3 讨论

植物活性物质的提取，其过程中目标产物的得率受料液比、材料粉碎度、浸提温度和提取剂等多种因素的影响，在一定范围内目标产物的得率随着料液比的增加而增大，当达到一定程度后得率不再增加，这是由于在特定条件下一定比例的溶剂已基本将其提取完全[23-24].响应面优化法通过对回归方程的拟合度以及响应面工艺回归模型的建立，可方便地求出相应于各因素水平的响应值.采用HPLC初步定性分析了太空茄子叶总黄酮的组分，未对单一组分得率为目标进行分析研究，在后续试验中仍需进一步完善.通过优化太空茄子叶总黄酮的最佳工艺参数，为后续总黄酮及其单体组分分离提供基础数据，对扩大农作物资源、食品、生物工程以及化工领域的综合利用范围，提高其附加值，具有很好的社会效益和经济效益.

4 结论

用响应面法分析优化太空茄子叶总黄酮的提取条件，经优化后的提取工艺可使太空茄子叶总黄酮提取率保持在9.82%以上的水平.通过单因素试验和响应面分析、优化提取太空茄子叶总黄酮的最佳工艺条件为：提取时间1.8 h、料液比1∶42(g∶mL)、提取温度80 ℃、乙醇体积分数78%，最佳总黄酮得率可达9.82%.同时得到太空茄子叶总黄酮得率与各提取条件的二次多项式模型，该模型拟合度较好.通过定性试验，其结果表明太空茄子叶黄酮提取物中含有多种黄酮类物质；由液相色谱结果可知其中含有芦丁、槲皮素、阿魏酸.