匙吻鲟形态特征及其两种同工酶的电泳分析

张涛，吴金平，陈建武，何力

(农业农村部水产品质量安全风险评估实验室(武汉)，农业部淡水鱼类种质监督检验测试中心，中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223)

匙吻鲟(Polyodonspathuln)隶属鲟形目(Acipenseriformes)、匙吻鲟科(Polyodontidae)，主要分布在美国北部一些天然水域，包括密西西比河流域以及从亚拉巴马州西部到德克萨斯休伦湖、伊利湖和密执安湖等水域[1].1988年我国首次引进这一优良品种，当年即在湖北省仙桃市试养成功[2].于2001年3月宜昌市天峡特种渔业公司率先取得匙吻鲟的全人工繁殖成功[3].2009年2月25日全国水产原良种审定委员会将匙吻鲟审定为良种，认为该品种适宜在我国内陆水域推广养殖[4].由于匙吻鲟具有体型体色好，食性类似于鳙，养殖成本低，生长速度快，养殖经济效益显著，其卵经加工后可制成具有较高经济价值的鱼子酱，目前已在多个省份推广养殖，以池塘和水库养殖居多.为促进匙吻鲟这一优良品种的标准化生产，保护和增殖匙吻鲟种群，有必要推进制定其种质标准工作进度，而形态特征和生化遗传特性是制定种质标准所需考察的重要参数.形态特征是最为简单和直观的种质资源鉴定参考指标[5].鉴于同工酶标记能较好的反映种属特性和遗传多样性，也就作为最常用的生化遗传标记应用在鱼类种质鉴定等领域中[6].自从发现乳酸脱氢酶开始，人们就着手认识和研究同工酶了，乳酸脱氢酶是研究最透彻的同工酶之一，鱼类乳酸脱氢酶多由3种基因编码，即LDH-A、LDH-B和LDH-C，其中LDH-C基因在鱼类中一般具有组织特异性，电泳时通常趋向阴极.LDH能使细胞在供氧不足情况下仍能进行正常的生理活动，保证肌纤维在缺氧而机体尚需剧烈运动时仍能继续完成葡萄糖的无氧酵解过程，以提供ATP补充肌肉收缩所需能量.酯酶可催化生物体内多种脂类的分解反应，它是可催化脂类化合物水解的一系列非特异性酶组成的酶系.LDH和EST在机体中扮演重要的生理功能，已有的研究表明可作为生化遗传标记用于不同种鲟鱼的种质鉴定[7].目前有关匙吻鲟形态特征的报道主要有王学功[4]、董宏伟[8]、王凡[9]、刘耀辉[10]以及陈细华[11]等，但现有报道多是关于匙吻鲟外部形态特征的描述，缺乏可量性状等数据，或者即使有少数可量性状数据，又缺乏内部构造特征等相关数据，因此尚未见较为系统的匙吻鲟形态特征报道.有关匙吻鲟生化遗传特性方面的报道仅见王学功等[4]、张海花等[12]的研究.但未见关于匙吻鲟各主要组织的多种同工酶表达情况的报道.本研究通过观察匙吻鲟外部形态特征并作描述、测定其可量可数指标，同时借助聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究匙吻鲟5种组织中的乳酸脱氢酶和酯酶表达情况.旨在进一步丰富匙吻鲟形态特征和生化遗传方面的研究内容，同时筛选出鉴定其种质的生化遗传标记，为制定匙吻鲟种质标准、探讨种质鉴定在匙吻鲟标准化生产和增殖过程中的应用开展基础工作.

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用匙吻鲟为水泥池人工繁殖培育的成鲟，于2018年4月采自湖北仙桃，共31尾，体质量185.2～667.3 g，均值(358.62±100.25)g；体长37.8～55.8 cm，均值(45.54±4.16)cm.

1.2 试验方法

1.2.1 形态测定 按照《GB/T 18654.3-2008 养殖鱼类种质检验·第3部分：性状测定》[13]的规定，用游标卡尺(精确到0.01 mm)对31尾匙吻鲟进行测定.可量性状包括全长、体长、体高、头长、吻长、吻宽、眼径、眼间距、尾柄高和尾柄长，共10个指标.可数性状包括背鳍、胸鳍、腹鳍和臀鳍的鳍式、脊椎骨总数以及幽门垂总数，共6个指标.

1.2.2 组织酶液的制备、电泳和染色 除EST所用凝胶浓度为9.5%的连续胶外，组织酶液的制备、电泳及染色参照张涛等[14]的方法.

1.2.5 绘制电泳图谱模式图 借助Bandscan 5.0对本研究所获电泳图谱中的酶带进行灰度识别，结合灰度识别绘制电泳图谱模式图.

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 形态描述及可数、可量性状

观察31尾匙吻鲟(图1)体表裸露无鳞、湿润，身体呈流线型，背部灰黑色，可见一些斑点夹杂于其中，自背部往腹部方向两侧逐渐变浅，腹部灰白色.头部有一大而长形如匙柄的吻.口较大，位于吻末端腹面.眼小，位于口前端上方.鳃耙较长而且较薄，排列细密.鳃盖大而向后延伸至胸鳍至腹鳍的1/2处.胸鳍短小，下位，背鳍起点位于腹鳍起点之后，身体在腹鳍前浑圆，腹鳍之后逐渐侧扁，尾柄披有甲鳞，该甲鳞为梗节状.尾鳍歪形，上叶长于下叶，不对称，上叶尖长，下叶宽短.

图1 匙吻鲟外观形态Figure 1 Morphological measurement of Polyodon spathuln

体内骨骼大部分由软骨组成，鳔为一室，呈梭形.表1给出了匙吻鲟可数、可量性状，均值反映了所测指标的集中程度，范围给出了各测定指标的上下限.可数性状中变异程度较大的有背鳍条数和臀鳍条数.可量性状中给出了眼径、眼间距和吻长等头部主要参数与头长的比例关系，也反映了尾柄长、尾柄高和体高等躯干部主要参数与体长的比例关系以及吻长与吻宽、尾柄长与尾柄高的比例关系.

2.2 LDH的表达

匙吻鲟5种组织的LDH同工酶表达情况见图2，5种组织中共检测到5条LDH酶带，将离阴极最远的一条LDH酶带定义为LDH1，自阳极向阴极方向各LDH酶带依次编号为LDH2、LDH3、LDH4、LDH5.从图2可以看出匙吻鲟LDH呈现出明显的组织特异性，表现在不同组织中酶带数目和活性不同.心脏组织中共有4条酶带检出，LDH1～LDH3在5尾样本鱼中都有表达，其中LDH1和LDH2表达活性程度较强，LDH3表达活性次之，LDH4活性最弱，而且LDH4在3号鱼和4号鱼中未检出(图2-A)；眼睛晶状体组织中共检测到4条酶带，5尾不同样本鱼酶带条数不同，仅4号鱼中未检出LDH4，LDH1～LDH3为5尾样本鱼共有的酶带，LDH2和LDH3表达活性较强(图2-B)；LDH在肌肉组织中表达活性较其它4种组织都弱，仅检测到2条LDH酶带，5尾样本鱼的酶带数不同，LDH1仅在3号鱼中有检出，LDH2为5尾样本鱼共有的酶带(图2-C)；脾脏中共检测到5条LDH酶带，LDH2～LDH5为5尾样本鱼共有的酶带，5尾不同样本鱼酶带条数和活性不同，除3号鱼和4号鱼中未检测到LDH1酶带外，其余3尾均有检出，而且2号鱼和5号鱼的LDH2和LDH5表达活性较其它3尾鱼强(图2-D)；肝脏组织中共检测到5条酶带，5尾样本鱼LDH酶带数和表达活性均相同，为单态，LDH1表达活性最弱，LDH4和LDH5表达活性最强，其余2条酶带表达活性居中(图2-E).

表中可量性状单位是cm；

The unit of measurable parameters in Tab.1 was centimeter.

A、B、C、D、E分别表示心脏、眼睛晶状体、肌肉、脾脏和肝脏的LDH酶谱；1～5泳道分别表示不同个体的酶谱.A,B,C,D,and E show electrophoretograms of LDH isozymes expressed in heart,eye,muscle,spleen and liver respectively.1～5 show the zymograms of different individuals.图2 匙吻鲟5种组织LDH电泳图谱Figure 2 Electrophoretogram of LDH isozymes expressed in five tissues of Polyodon spathuln

2.3 EST的表达

匙吻鲟5种组织EST同工酶的表达情况见图3，5种组织中共检测到5条EST酶带，将靠近离阴极最远的一条EST酶带定义为EST1，自阳极向阴极方向各EST酶带依次编号为EST2、EST3、EST4、EST5.从图3可以看出匙吻鲟EST也呈现出一定的组织特异性，不同组织中EST酶带数和活性不同.心脏组织中共有2条EST酶带检出，各样本鱼的酶带数和表达活性相同，EST2表达活性较强，另一条酶带表达活性相对较弱(图3-A)；所有样本鱼的眼睛晶状体组织中未检测到EST的表达(图3-B)；EST在肌肉组织中表达活性相对其它3种组织低，仅1号鱼检测到2条EST酶带，其余4尾鱼均只检测到1条即EST2酶带(图3-C)；和心脏组织相同，EST在5尾样本鱼脾脏中均检测到2条EST酶带，各样本鱼2条EST酶带表达活性相同(图3-D)；5种组织中EST在肝脏组织中的表达的酶带数最多，共检测到4～5条EST酶带，EST5仅在1号鱼和2号鱼中有检出，EST1～EST4为5尾样本鱼的共有酶带，EST3表达活性最强，EST2和EST4表达活性居中，其余2条酶带表达活性最弱(图3-E).

A、B、C、D、E分别表示心脏、眼睛晶状体、肌肉、脾脏和肝脏EST酶谱；1～5泳道分别表示不同个体的酶谱.A,B,C,D,and E show electrophoretograms of EST isozymes expressed in heart,eye,muscle,spleen and liver respectively.1～5 show the zymograms of different individuals.图3 匙吻鲟5种组织EST电泳图谱Figure 3 Electrophoretogram of EST isozymes expressed in five tissues of Polyodon spathuln

2.4 匙吻鲟生化遗传标记

本研究中5尾样本鱼心脏、眼晶状体、肌肉和脾脏组织中LDH酶带均有多态，表现在不同样本鱼之间LDH酶带数不同，或者即使酶带数相同但表达活性程度不同(图2).所有样本鱼肝脏中LDH酶带数和表达活性虽都相同，但有拖带，分离效果并不理想(图2-E)，而且肝脏成分相对较为复杂，离心后容易形成脂肪层，吸取上清液电泳时容易引入杂质影响电泳效果.5尾样本鱼的眼晶状体组织中未检测到EST的表达(图3-B)，肌肉中EST表达活性很低(图3-C)，而且肌肉和肝脏中EST的表达呈现出个体差异性(图3-C～E)，不适宜作为匙吻鲟的特征生化遗传参数.而脾脏中虽然各样本鱼EST表达的酶带条数和活性相同，但有拖带，分离效果欠佳(图3-D).5尾样本鱼心脏中EST表达活性和酶带条数都相同，为单态，而且酶带清晰，分离效果好(图3-A)，因此拟采用心脏EST作为从生化遗传层面鉴定匙吻鲟种质的考察指标.进一步选取30尾样本鱼的心脏组织在相同实验条件下电泳，以确定30尾匙吻鲟心脏组织EST酶带表达情况，所有样本鱼心脏组织EST同工酶表达情况相同，随机选取10尾样本鱼心脏组织EST图谱见图4，所有样本鱼EST酶带数和表达活性程度相同.因此，本研究采用心脏组织EST作为鉴定匙吻鲟种质的生化遗传标记.

1～10泳道分别表示不同个体的酶谱.1～10 show the zymograms of different individuals.图4 匙吻鲟心脏组织EST电泳图谱Figure 4 Electrophoretogram of EST isozymes expressed in heart from Polyodon spathuln

3 讨论

3.1 匙吻鲟的形态学比较

3.1.1 匙吻鲟形态特征比较 通过与文献中已报道匙吻鲟的形态特征比较，本研究结果与已有文献在可数性状方面比较接近，不同之处主要在可量性状比值方面.本研究与王学功等[4]的研究结果相比，除体长/吻长外，其他诸如体长/体高、体长/头长等参数的变动范围，两者的研究结果吻合，但本研究与王学功[4]关于体长/吻长的研究结果分别为2.37～2.96和1.13～2.39.本研究结果与董宏伟[8]的研究结果相比，除体长/头长、尾柄长/尾柄宽外，其他诸如体长/体高、吻长/吻宽等参数的变动范围，两者的研究结果吻合，但本研究与董宏伟[8]关于体长/头长的研究结果分别为1.63～1.89和4.76～5.75，关于尾柄长/尾柄宽的研究结果分别为1.36～2.21和1.14～1.30.造成这一差异的原因可能与所测样本鱼的规格和样本量大小有关.如本研究、王学功[4]、董宏伟[8]所测样本鱼的体长范围分别为37.8～55.8、34.9～69.7、47.7～49.6 cm，样本量分别为31尾、不详和10尾.也可能是由于三者的测量方法不同，尤其是对同一个参数的测量起始和终末点的认识和界定不同，导致测量结果差异.鉴于此，建议研究鱼类形态特征时严格遵照《GB/T 18654.3-2008养殖鱼类种质检验·第3部分：性状测定》[13]中关于各可量性状参数的国标方法进行测定.

3.1.2 与白鲟形态比较 鲟形目鱼类现存2科即匙吻鲟科(Polyodontidae)和鲟科(Acipenseridae)，而匙吻鲟科下分2属2种，匙吻鲟属(Polyodon)的匙吻鲟(Polyodonspathuln)和白鲟属(Psephurus)的白鲟(Psephurusgladius).两者外部形态特征相同之处：吻都较长，体表均裸露无鳞，腹部皆为灰白色；背鳍均靠后，离尾鳍较近；腹鳍起点均在背鳍起点前下方；身体均在腹鳍前浑圆，自腹鳍后逐渐变细；尾鳍均为歪形尾，上叶长于下叶；两者眼睛都很小，视觉不发达；口都较大，位于吻末端腹面.两者外部形态不同之处见表2.

匙吻鲟主要生活在淡水中，性情相对温顺，喜欢栖息在流速中等的水体中，主要摄食浮游动物.白鲟属江海洄游型鱼类，以淡水生活为主，健勇凶猛，为单纯的动物食性，以鱼类为主要食物，其次是虾蟹[11].分析认为匙吻鲟与白鲟形态上的差异与其生态环境以及食性有关，如白鲟吻端较尖、略向上翘与其游泳速度快、洄游距离长相适应.匙吻鲟吻端圆滑、呈扁平浆状与其游泳速度相对较慢、性情较为温顺相关.白鲟口中有牙，而匙吻鲟仅在幼体时有牙，这与两者食性不同密切相关.

表2 匙吻鲟与白鲟外部形态特征比较

3.2 同工酶表达的组织特异性

本研究发现匙吻鲟的各主要组织中均有LDH同工酶检出(图2)，由此可以看出匙吻鲟体内广泛分布着LDH同工酶，而EST同工酶在除眼晶状体外的4种组织中有表达.本研究中匙吻鲟LDH和EST同工酶的表达具有组织特异性，表现在同一个体的不同组织中即使同一种同工酶表达的酶带数和活性程度不同.如匙吻鲟心脏中共有3～4LDH条酶带检出(图2-A)，而其肌肉中仅检测到1～2条LDH酶带(图2-C)，肌肉LDH表达活性程度比其它组织弱，相应的表现在其酶带着色浅和染色时显色最慢.匙吻鲟EST同工酶的表达也表现出组织特异性(图3)，如本研究中心脏和肝脏中EST酶带表达活性都比肌肉组织强(图3)，张海花[12]在研究匙吻鲟4种组织酯酶时也得到同样的结果.EST同功酶能通过水解大量非生理存在的脂类化合物具有解毒功能，而肝脏是重要的解毒器官，自然要求其中EST同功酶的表达活性较高，而肌肉没有解毒功能，相应其EST同功酶的表达活性也较低，所以某组织或器官同工酶表达活性与其行使相应生理功能密切相关.造成这种组织特异性表达的原因可能是由于组织或者器官中同工酶的表达受到遗传基因的调控，然而酶基因的表达对组织或器官有选择性，仅在一些专属的组织或器官中有表达；另一方面也不排除是为便于不同组织行使不同的生理功能，从而使遗传因子表达后受到不同基因的调控，因而造成组织或器官间同类同工酶在含量和活性表达上的不同[17].

3.3 同工酶表达的个体差异性

本研究中匙吻鲟心脏、眼晶状体、肌肉和脾脏组织LDH同工酶均表现出明显的个体差异性(图2)，表现在即使相同组织不同个体LDH同工酶酶带数不同，表达活性也存在差异，如3号鱼的心脏组织和脾脏LDH酶带数分别为3条和4条，而5号鱼分别为4条和5条(图2-A，D).EST同工酶也存在类似的现象，如1号鱼的肌肉和肝脏组织中EST同工酶酶带数分别为2条和5条，而5号鱼分别为1条和4条(图3-C，E).个体差异性除表现在酶带条数外，还表现在酶带的表达活性程度上，如2号鱼和5号鱼脾脏组织中LDH2表达活性比其余3尾鱼脾脏中LDH2表达活性强(图2-D).其他学者也发现过类似现象，如余敏等[18]的研究.可见同工酶在同一物种不同个体相同组织中的表达存在差异，分析这一现象的原因，可能与处于不同生长发育阶段、健康状态、地理环境(生境)等因素有关[19-21].推测本研究中匙吻鲟同工酶表达的个体差异可能与不同样本鱼的规格或健康状况有关，但具体原因有待进一步探索.

3.4 匙吻鲟生化遗传标记

关于匙吻鲟生化遗传标记的研究，王学功等[4]报道了匙吻鲟心脏组织中EST有2个基因位点，其表现型为2条谱带，这一研究结果与本研究吻合.此外张海花等[12]比较了高首鲟(Acipensertransmonstanus)、匙吻鲟和杂交鲟(Hdauricus♀×Aschrencki♂)心脏组织同工酶的表达情况，发现高首鲟和匙吻鲟EST同工酶活力高于杂交鲟，3者呈现不同的多态性.这一研究结果佐证了心脏组织EST可作为匙吻鲟区别其他鲟鱼生化遗传标记的可能性.本研究通过综合比较匙吻鲟5种组织中LDH和EST的表达结果发现：心脏组织EST同工酶酶带清晰，分离效果好，表达稳定，没有个体差异，可作为鉴定匙吻鲟种质的生化遗传标记，也可为制定匙吻鲟种质标准提供生化遗传指标，该技术已运用在其它鲟类中.种质标准“GB/T 32781-2016中华鲟”[22]和“GB/T 33111-2016达氏鲟”[23]中分别将中华鲟和达氏鲟的眼晶状体苹果酸脱氢酶(MDH)作为鉴定两者种质的生化遗传标记.赵金良[24]的研究表明，人工雌核发育团头鲂与选育群体在酯酶上存在稳定差异，并可将两个群体酯酶上的差异作为区分两者的生化遗传标记.Chen[25]发现，藏北高原色林错裸鲤、纳木错裸鲤和错鄂裸鲤的LDH、MDH和EST 3个酶谱均表现出种间的差异，而且在同一种群的不同个体间也存在明显的分化.

4 结论

本研究采用观察描述匙吻鲟外部形态特征、测定其可数、可量性状，并与分类地位相近鲟类比较，研究结果可直观的从形态学特征角度对匙吻鲟种质鉴定提供参考指标.同时借助聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳对匙吻鲟5种组织(心脏、眼晶状体、肌肉、脾脏和肝脏组织)LDH和EST进行了分析，2种同工酶具有组织特异性，确定了心脏组织EST可作为鉴定匙吻鲟种质的生化遗传标记.本研究结果可为制定匙吻鲟种质标准提供参考依据.