基于网络药理学左金丸治疗胃溃疡的机制

卜雕雕， 苏 卓， 张 丹， 柏希慧， 王昌利

（陕西中医药大学药学院，陕西 咸阳712046）

左金丸源自《丹溪心法》，由吴茱萸、黄连（6 ∶1） 组成，前者功效散寒止痛、降逆止呕，属于热性药；后者功效清热泻火解毒，属于寒性药。临床常将两者配伍使用，两药一辛一苦、一热一寒、一升一降，相辅相成共同发挥药效，组成左金丸后具有清热泻火解毒、降逆止呕、散寒止痛功效［1］。现代药理学研究对左金丸的研究较少，主要集中在 慢 性 胃 炎［2］、 胃 肠 疾 病［3］、 消 化 道 溃疡［4］等，以抗溃疡为主。其中，胃溃疡属于消化性溃疡，是指在胃角、贲门、胃窦和裂孔疝等部位发生的溃疡，其致病因素包括胃酸增多、黏膜破坏、遗传、饮食、药物、吸烟、全身性疾病、精神疾病等。

中药普遍有多成分、多靶点的特点，导致研究其治病机制时存在困难。2007 年，英国药理学家Hopkins 首次提出“网络药理学” 的概念［5］，它对药物-药物、药物-疾病网络进行分析，不局限于单一成分、单一靶标、单一疾病，可阐明中药“多组分-多成分-多靶点-多环节” 的特点，对中医药现代化发展产生积极推动作用［6］。因此，本研究采用网络药理学对左金丸治疗胃溃疡的机制进行研究，为其发挥临床疗效提供了依据。

1 材料与方法

1.1 成分收集 在中药系统网络药理学数据库和分析平台［7］（TCMSP，http： ／／lsp. nwu. edu. cn／tcmsp.php） 输入“吴茱萸” “黄连” 收集两者成分，选择口服生物利用度（OB） ≥30%和药物相似性（DL） ≥0.18 者作为筛选出的活性成分［8］。在ChemDraw Pro 16.0 中画出活性成分结构式，保存为MDL Molfile（. mol） 格式，利用OpenBabel软件中的convert 功能将上述格式转化为Sdf-MDL MOL format 备用［9］。

1.2 活性成分靶点预测 进入Swiss Target Prediction （http： ／／www. swisstargetprediction. ch／） 数据库，在绘图区粘贴上述Sdf-MDL MOL format 格式文件，点击Import-Predict the target 即可输出化合物靶点信息［10］。在数据库搜索的药物靶点命名存在不规范问题，故把所有靶点导入UniProt（https： ／／www.uniprot.org／） 数据库中，输入靶点蛋白名称限定物种为“Homo sapiens”，将所有蛋白名称均校正为其官方名称（official symbol）。将所得吴茱萸、黄连主要活性成分的靶点与pharm GKB（https： ／／www. pharmgkb. org／）、CTD（http： ／／ctdbase. org／）、 GeneCards （https： ／／www.genecards.org／） 数据库中查询到的与胃溃疡有关的靶点比对分析，筛选左金丸治疗胃溃疡可能潜在的靶点。

1.3 靶点类型归属 DisGeNET （http： ／／www.disgenet.org／web／DisGeNET／menu／search） 是一个包含与人类疾病相关的基因和变体集合的公开数据库，将“1.2” 项下潜在靶点输入DisGeNET，得到靶点类型（Protein Class）。

1.4 蛋白-蛋白相互作用网络构建 将所得左金丸作用靶点导入string 数据库 （https： ／／string-db.org／）［11］，选择Multiple protein， 限定物种为人，得到蛋白相互作用，导出node1、node2、Combined score 值导入cytoscape 软件，并设置节点大小及颜色反应degree 值、score 值，最终得到蛋白互作网络图。

1.5 GO 功能、KEGG 通路富集分析 将30 个左金丸治疗胃溃疡的潜在靶点通过cytoscape 的ClueGO 插件进行GO 生物学功能分析，将靶点输入DAVID（database for annotation，visualization and integrated discovery） 进行KEGG 通路分析。以P＜0.05 为筛选条件，得到相关分析结果。

1.6 左金丸活性成分-靶点-通路网络构建 采用cytoscape3.6.1 软件中的Merge 功能，构建药材-活性成分-靶点-通路网络图。其中，节点（node） 代表药材、活性成分、靶点和信号通路，边（edge）用来连接单味药、活性成分、靶点和信号通路。

1.7 分子对接验证 选择上述网络图中度值排名前5 的靶点，查找其PDB ID，输入systems Dock Web Site（http： ／／systemsdock.unit.oist.jp／iddp／home／index） 中与左金丸治疗胃溃疡的活性成分进行分子对接，保存结果，用其Docking Score 评价化合物和靶点的结合活性。

2 结果

2.1 左金丸活性成分筛选 通过TCMSP 搜索到吴茱萸176 种活性成分，其中OB≥30、DL≥0.18 的共30 种； 黄连48 种活性成分， 其中OB ≥30、DL≥0.18 者共14 种。去除重复成分，最终得到41 种，具体见表1。

2.2 左金丸活性成分靶点信息、 靶点类型归属 将潜在活性成分的Sdf-MDL MOL format 格式文件上传到Swiss Target Prediction 数据库，预测吴茱萸和黄连活性成分的靶点，41 种活性成分对应615 个靶点，去除重复的靶点后还剩余228 个。再应用pharm GKB、CTD、GeneCards 数据库搜索与胃溃疡（Gastric ulcer） 相关的靶点，与上述228个靶点比对分析后，得到30 个治疗胃溃疡的潜在作用靶点，见表2，可知一个靶点可对应多种化学成分，如TDP1 （14 个）、 CDK1 （8 个）、 CDK2（8 个）、CYP2D6（7 个）、ADRA2A（6 个） 等频数较高。然后，将30 个靶点输入DisGeNET 数据库，得到靶点类型的信息（表2），包括酶（水解酶、氧化还原酶、转移酶、连接酶、激酶、蛋白酶等）、转运体、转录因子、受体、核酸结合等，表明左金丸能通过不同靶点类型发挥药效。

2.3 左金丸潜在靶点之间作用分析 利用string数据库和cytoscape 软件得到靶点相互作用网络图，见图1。由图可知，该网络图中只用24 个靶点，其余靶点之间无相互作用，故网络图中未显示；包含24 个节点、55 条边，degree 值越大，节点越大，而Combine score 值越大，边越粗，其中具有较大度 值 （degree ≥7） 的 蛋 白 质 为 HSP90AA1、PTGS2、NOS3、MMP9，表明左金丸治疗胃溃疡可能通过多个靶点联合共同发挥作用。

2.4 靶点生物学功能注释 通过cytoscape3.6.1的ClueGo 插件对左金丸治疗胃溃疡潜在靶点进行GO 生物学功能分析，结果见图2，可知左金丸治疗胃溃疡的药效机制可能与神经递质代谢过程、四吡咯结合、血红素结合、神经递质等有关。GO 属于基因功能分类体系，有3 个分支， 即生物过程、分子功能、细胞组分，而左金丸治疗胃溃疡的靶点在生物过程中主要富集到氧化还原过程、钙离子转运负调控、精氨酸分解过程等；细胞组成中富集到细胞器膜、细胞质膜、管基底等离子体膜等；分子功能中富集到血红素结合、一氧化氮合酶活性、铁离子结合等生物学过程，即涉及多个生物学过程。

表1 左金丸活性成分Tab.1 Active components of Zuojin Pills

表2 左金丸活性成分潜在靶点Tab.2 Potential targets for active components of Zuojin Pills

图1 左金丸潜在靶点之间相互作用网络图Fig.1 Network diagram of interactions among potential targets for Zuojin Pills

2.5 靶点通路注释分析 图3 显示，13 个通路被富集，其中新陈代谢、氨基酸代谢通路2 条，包括Arginine biosynthesis、 Arginine and proline metabolism；新陈代谢、脂质代谢通路1 条，包括Arachidonic acid metabolism；新陈代谢、外源性物质生物降解和代谢通路1 条，包括Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450；人类疾病、癌症通路4 条，包括Pathways in cancer、Chemical carcinogenesis、Small cell lung cancer、Prostate cancer；有机系统、内分泌系统通路2 条，包括Ovarian steroidogenesis、 Progesterone-mediated oocyte maturation；有机系统、神经系统通路1 条，包括Serotonergic synapse；环境信息处理、信号转导通路1 条，包括Calcium signaling pathway，表明左金丸治疗胃溃疡活性成分的靶点分布在多个通路中，从而协调发挥治疗作用。

图2 GO 生物学功能分析Fig.2 GO biological function analysis

图3 KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 药材-成分-靶点-通路图 采用cytoscape 软件的merge 功能构建药材-成分-靶点-通路网络图，见图4。由图可知，该网络有67 个节点（包括2 味中药、32 种成分、20 个靶点、13 条通路） 和149条边，节点越大，度越大，与其相连的节点数越多，其中吴茱萸次碱、β-谷甾醇、谷甾醇、槲皮素、广 玉 兰 内 酯、 1-（5， 7， 8-trimethoxy-2， 2-dimethylchromen-6-yl） ethanone、icosa-11，14，17-trienoicacidmethylester、31-去甲基-9（11） -羊毛甾烯醇等度值较大，表明其作用靶点多。另外，靶点节点越大，靶点度越大，与其相连的成分越多，而图4 中PTGS2、CDK1、CDK2、NOS3、SLC6A4 等靶点节点较大，可能为药物作用的靶点。

图4 药材-成分-靶点-通路图Fig.4 Medicinal material-component-target-pathway diagram

2.7 分子对接 将图4 中度值排名前5 的靶点CDK2 （PDB ID： 2R3I）、 PTGS2 （PDB ID：1Q4G）、CDK1（PDB ID：1X8B）、CYP2D6（PDB ID：1Z10）、HSD11B1（PDB ID：1XU9） 与41 种成分进行分子对接， 结果见表3。 由表可知，docking score＞7 的有28 种（13.7%），介于5～7 的有129 种 （62.9%）， 介于4.25 ～5 的有24 种（11.7%），小于4.25 的有24 种（11.7%），由于大于4.25 时表示药物分子与靶蛋白间存在结合能力，大于5.0 时表示结合活性较强，大于7.0 时表示结合能力极强［12］，而本研究中大于4.25 者占总数88.3%，即大部分靶点与成分的结合活性较好。

3 讨论

左金丸常用于肝火犯胃证，临床用于治疗胃溃疡、慢性胃炎等。方中黄连、吴茱萸含多种药效成分，例如小檗碱对胃肠运动作用具有促进作用，对胃肠黏膜具有较好的保护作用［13］；吴茱萸次碱具有浓度依赖性的肌肉松弛作用［14］，并且吴茱萸次碱能降低乙酰水杨酸诱导的大鼠胃溃疡的胃溃疡指数，对于血浆中CGRP（降钙素基因的相关肽） 浓度具有明显的强作用，并能被辣椒素受体阻断剂capsazepine（一种竞争性辣椒素受体拮抗剂） 阻断，表明该成分对胃黏膜的保护作用可能是通过激动辣椒素受体，从而对内源性CGRP 释放起到促进作用［15］。杨炳友等［16］证实，吴茱萸多糖、吴茱萸内酯对胃溃疡有较好的治疗效果，随着剂量加大其抗溃疡作用也随之增强，而且两者可协同降低胃蛋白酶活性；黄连素抗菌谱广，能杀灭幽门螺旋杆菌，同时可抑制胃酸分泌，对胃溃疡有一定的治疗效果［17］；李备［18］证实，黄连及其所含的生物碱可抑制胃酸分泌，改善胃黏膜血流供应，提高胃黏膜屏障功能，调节神经体液，抑制致炎因子产生，抗脂质过氧化，从而保护胃黏膜，可作为治疗消化性溃疡的药物。另外，黄连、吴茱萸按不同比例配伍后的药效均比单味药强，可抑制胃酸与胃蛋白酶活性，从而使胃黏液分泌增加，减轻攻击因子对胃黏膜的损伤，从而增强“胃-黏液-碳酸氨盐” 的屏障作用［19］。

本研究在GO 生物学过程富集分析时发现，左金丸治疗胃溃疡的基因在生物学过程中主要富集到氧化还原过程、钙离子转运负调控、精氨酸分解过程等；细胞组成富集到细胞器膜、细胞质膜、管基底等离子体膜等；分子功能包括血红素结合、一氧化氮合酶活性、铁离子结合等生物学过程。前期报道，左金丸可通过抑制乙酰胆碱来引起Ca2+浓度的升高，从而进一步抑制牛肾上腺髓质细胞分泌儿茶酚胺，后者过量时会引起胃黏膜血管萎缩，使黏膜血液流动缓慢，诱发黏膜缺血和缺氧，最终导致溃疡产生［20］；还可提高胃液pH 值，对胃黏膜攻击因素具有降低作用，使其防御功能增强，促进胃溃疡愈合，最终有效预防大鼠胃溃疡［21-22］。另外，NO 属于神经递质和信使分子，可发挥多种生物学效应，在正常生理状态下，少量NO 对胃黏膜微循环和黏液分泌具有调节作用，进而保护胃黏膜；在病理状态下， 过量NO 会引起正常基因发生突变［23］，与本研究结果吻合。

表3 分子对接结果Tab.3 Results of molecular docking

KEGG 通路富集分析时，富集到13 条P＜0.05者，其中5-羟色胺突触、花生四烯酸代谢、癌症途径等通路与胃溃疡相关。林科名等［24］证实，左金丸可调节多种神经递质，降低应激性胃溃疡大鼠的脑、肾上腺组织中去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、多巴胺（DA） 等单胺类神经递质浓度，其发挥抗应激性胃溃疡的作用机制是通过神经体液途径来实现的；花生四烯酸主要代谢产物是前列腺素 （PGs），具有保护胃黏膜的作用， 其中PGE2具有多种生物学功能，是局部保护胃黏膜的保护因素，一方面PGE2能使胃黏膜血流量、血管通透性、腺体黏液分泌增加，进而使局部黏膜屏障功能增强［25］；另一方面能促进胃黏膜上皮细胞再生，诱导黏膜基底细胞向表面移行，进而对溃疡面自身修复起到促进作用［26］，与本研究结果吻合。

综上所述，本研究构建左金丸“药材-成分-靶点-信号通路” 网络图，其中包括2 味中药、32 种成分、20 个靶点、13 条信号通路，其中吴茱萸次碱、icosa-11，14，17-trienoic acid methyl ester、槲皮素、广玉兰内酯等均有较大度值，可能是抗胃溃疡的关键成分； 重组人周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）、周期素依赖性激酶1 （CDK1）、细胞色素P450 2D6（CYP2D6）、人皮质类固醇11β 脱氢酶同工酶1（HSD11B1） 在众多靶点中拥有较高度值；5-羟色胺突触、花生四烯酸代谢、癌症途径等通路是发挥抗胃溃疡作用的主要潜在信号通路。由此可知，左金丸主要活性成分通过调控多个靶点、多个信号通路来发挥抗胃溃疡的作用，即有着“多成分-多靶点-多通路” 的特点，可为今后验证该制剂具体作用靶点和信号通路提供依据。