休眠方式、温度和时间对离水储藏鲫鱼生理指标的影响

曾 鹏，申 江，陈天及

( 1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306； 2.天津商业大学 机械工程学院，天津 300134 )

活鲜鱼在储运过程中通常应用低温，麻醉同充氧等方式提高存活率[1-2]。但是这些储运手段中水的存在极大影响了运输过程中的成本，因此水产品的无水储运成为研究新方向[3]。冰温技术通过低温驯化增加了生物体的低温耐受性，在冰温条件下活体新陈代谢降低，鱼类处于休眠状态，从而达到无水运输的目的[4-5]。低温麻醉可以有效的对鱼类进行麻醉，但会导致血液成分发生变化[6]。0～0.5 ℃被认为是大西洋鲑(Salmosalar)低温休眠的温度下限[7]。

丁香油有效成分为丁香酚，作为食品添加剂，在用作麻醉剂时不需要停药期[8]。在鲤鱼(Cyprinuscarpio)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)等鱼类身上的试验发现丁香油的半数致死质量浓度比三卡因甲磺酸盐要高，比美国食品药品监督管理局批准使用的麻醉剂三卡因甲磺酸盐更安全[9]。丁香油在日本是可以使用的鱼用麻醉剂，药浴剂量为50～200 μg/L。鲫鱼可以在37～80 mg/L丁香油质量浓度下有效麻醉，随着质量浓度的增加，麻醉时间缩短，但复苏时间延长[10]。

笔者通过比较丁香油麻醉和低温诱导休眠对鲫鱼(Carassiusauratus)生理的影响，及观察离水后鱼体在不同储藏温度和时间下的生理变化及应激反应，来讨论休眠方式、温度及时间对试验鱼离水后储藏的影响。根据离水储藏过程中鲫鱼的生理变化，使用数据回归分析法探讨影响鲫鱼复苏的主要因素。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鲫鱼采自天津地区某养鱼池，选取健康成鱼，体表鳞片完整，体质量(395.90±43.71) g。根据以往研究选取两种休眠方式：由室温(14 ℃)以1 ℃/h速率降温至0 ℃诱导休眠；40 mg/L丁香酚浸浴2 min麻醉。

每组鲫鱼100尾，分别以两种休眠方式麻醉后，放置于聚乙烯周转箱中，鱼体下放置浸水吸水纸，以保持鱼体湿润，箱口遮盖纸板，防止冷库干耗。每种休眠方式组再随机分为3组，分别放置于冰温(0 ℃)储藏及4、8 ℃控温冷库(温度波动±0.2 ℃)中。自12 h起间隔12 h每组分别取出3尾取样分析。

1.2 各组织取样

血样：心脏静脉取血，使用肝素钠小管采集样品，低温离心20 min(4 ℃，4000 r/min)，制备血清，-80 ℃超低温冰箱保存待测。

肝胰脏及脑组织样品：组织分离后，称量质量后按1∶10加入50 mmol/L的磷酸钾溶液(pH 7.0，包含0.5 mmol/L乙二胺四乙酸)研磨破碎，然后低温离心20 min(4 ℃，4000 r/min)，取上清液离心30 min(4 ℃，12 000 r/min)，得去线粒体上清液及沉淀(线粒体)。-80 ℃超低温冰箱保存待测。

1.3 测试与分析

所有测试在取样后一周内进行，皮质醇、血糖、肝糖原及各项酶的测试均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行，以P<0.05表示差异显著，结果以平均值±标准差表示。使用SPSS 19.0软件进行试验数据的分析。以温度和时间为自变量，进行双因素方差分析，探究温度、时间对血液生理指标的影响；由于离水后的储藏是一个连续的变化过程，多类别逻辑有序回归有助于克服使用单一结局作为因变量的不足。使用数据回归分析法探讨影响鲫鱼复苏的主要因素，对鲫鱼离水储藏后生存能力(以复苏时间体现)作为自变量进行有序多分类回归分析，以复水后恢复平衡的时间分组作为因变量。1组恢复平衡时间为0～5 min，2组恢复平衡时间5～20 min，3组恢复平衡时间20～30 min，4组30 min内不能恢复平衡。以各项生理指标、储藏温度、麻醉方式和离水时间作为自变量。其中诱导休眠的方式定义为分类变量：低温休眠或丁香酚麻醉。

2 结 果

2.1 离水储藏过程中试验鱼糖代谢指标变化

两种休眠方式试验组均观察到，鲫鱼肝糖原水平均随储藏时间延长而差异显著(P<0.05，表现为其在离水储藏过程中消耗的趋势，图1)。丁香酚麻醉组肝糖原受到储藏温度影响，0 ℃贮藏组最高(P<0.05)。

图1 休眠方式、温度及时间对鲫鱼肝胰脏糖原含量的影响(n=3) 不同大写字母表示同一温度不同时间组差异显著(P<0.05); 不同小写字母表示同一时间不同温度组差异显著(P<0.05)，下同.

两组离水储藏过程中鲫鱼血糖水平均无明显变化(图2)。试验鱼经丁香酚麻醉后其血清皮质醇含量在储藏过程中无明显变化，而低温休眠鱼体不同，其血清皮质醇水平随储藏温度及储藏时间变化差异显著(P<0.05)，4 ℃储藏组水平较高，60 h后数值达到最高(图3)。

图2 休眠方式、温度及时间对鲫鱼血糖浓度的影响(n=3)

图3 休眠方式、温度及时间对鲫鱼血清皮质醇浓度的影响(n=3)

2.2 离水储藏过程中试验鱼血清乳酸及脑丙二醛含量变化

低温休眠组鲫鱼血清乳酸水平受储藏温度影响显著(P<0.05)，8 ℃储藏条件下较高。试验鱼在丁香酚麻醉后同样受储藏温度影响显著(P<0.05)，8 ℃储藏条件下血清乳酸水平较高,同时其数值受到储藏时间影响，表现为先升后降的趋势(图4)。脑丙二醛水平在两种方式诱导休眠后，均受储藏温度影响显著(P<0.05)，其中8 ℃储藏条件下较高(图5)。

图4 休眠方式、温度及时间对鲫鱼血清乳酸浓度的影响(n=3)

图5 休眠方式、温度及时间对鲫鱼脑丙二醛含量的影响(n=3)

2.3 离水储藏过程中试验鱼酶活力变化

两组试验鱼肝胰脏过氧化氢酶活力均受储藏温度影响显著(P<0.05)，较高的储藏温度(4、8 ℃)导致肝胰脏组织过氧化氢酶活力升高(图6)。而低温休眠组鲫鱼肝胰脏过氧化氢酶活力也受到了储藏时间的影响，在试验开始时即12 h时最高，随储藏时间延长显著降低(P<0.05)。

脑组织琥珀酸脱氢酶活力仅受储藏时间影响显著(P<0.05)，低温休眠组脑组织琥珀酸脱氢酶活力在60 h达到最高值，同时丁香酚麻醉组脑组织琥珀酸脱氢酶活力在储藏时间为48、60 h时较高(图7)。

图6 休眠方式、温度及时间对鲫鱼肝胰脏过氧化氢酶活力的影响(n=3)

图7 休眠方式、温度及时间对鲫鱼脑琥珀酸脱氢酶活力的影响(n=3)

血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶受储藏温度及储藏时间影响显著(P<0.05)，两者活力均随储藏时间延长及储藏温度升高而增加(图8、图9)。

2.4 数据回归分析

平行线检验结果为P=0.88>0.05，满足平行线假设，表明自变量可以应用有序逻辑回归模型。各项参数与平衡时间的回归模型见表1。其中储藏时间、储藏温度、血清皮质醇及肝糖原与平衡时间相关,而休眠方式、血糖、血清乳酸、血清谷草转氨酶谷草转氨酶、脑丙二醛、脑琥珀酸脱氢酶与鲫鱼离水储藏后的复苏时间无相关性。麻醉休眠方式对复苏时间无明显影响(P=0.86)，即采用低温休眠和丁香酚麻醉后离水储藏的鲫鱼其复苏时间无明显区别。

图8 休眠方式、温度及时间对鲫鱼血清谷丙转氨酶活力的影响(n=3)

图9 休眠方式、温度及时间对鲫鱼血清谷草转氨酶活力的影响(n=3)

表1 休眠方式、温度、时间及各项生理参数与平衡时间的有序回归

3 讨 论

3.1 麻醉及储藏因素对生理机能的影响

对鱼类胁迫反应的研究结果指出，皮质醇及血糖水平是反应鱼体生理状态的重要指标[11]。鲫鱼血清皮质醇水平在低温休眠组逐渐升高，而在丁香酚麻醉后离水储藏过程中皮质醇水平无明显变化。推测这是由于丁香酚能有效的缓解鱼类应激状态，有研究观察到罗非鱼(Oreochromis)在丁香酚麻醉中及麻醉后，其皮质醇含量明显降低[12]。丁香酚可以降低大口黑鲈(Micropterussalmoides)运输时的应激反应,在一定程度上降低大口黑鲈的生理生化变化,但长时间的运输后,丁香酚并不能抑制运输对鱼体造成的伤害[13]。

运输、低温等条件胁迫下，鱼体由于受到应激刺激导致内分泌系统中促儿茶酚胺和皮质醇的释放[14]，进而影响糖类及脂类的储备，尤其是肝糖原的储备，以满足机体快速代谢需求[15]。本研究在试验过程中观察到，胁迫过程中血糖无明显变化，这同Dindia等[16]的研究结果一致。随着鲫鱼离水时间延长，肝糖原逐渐消耗，脑琥珀酸脱氢酶活力升高。这可能是由于在极端条件下，鱼体通过调节不同代谢途径的酶含量、转换代谢途径和改变组织细胞的分子组成等方式, 使鱼体代谢和生理功能逐渐适应[17]。

温度影响质膜的流动性，进而改变新陈代谢物质的运输，同时调控多项应激介导的信号通路[18]。本研究显示，较高的储藏温度导致脑丙二醛含量、乳酸含量及过氧化氢酶活力升高。丙二醛作为细胞膜氧化损伤的指示物，是脂质过氧化作用中衍生的代谢物[19]。离水操作胁迫后的红鳍东方鲀(Takifugurubripes)过氧化氢酶活力呈先升后降趋势，丙二醛含量持续升高[20]。试验中低温休眠组鲫鱼肝胰脏过氧化氢酶活力随储藏时间延长而降低，这可能因为鱼体受外界刺激机体免疫机制受到刺激发挥作用,抗氧化酶活性升高，而当达到机体的耐受极限后,酶活力反而会被抑制[21]。

血清中酶活力的变化能够反映机体代谢和物质转化的状况，以及组织结构功能的不同状态，是机体组织细胞膜完整性的一个重要标志[22]。低温胁迫下膜脂流动性和弹性减弱，膜脂的不对称性增加，使得膜紧缩不均而造成膜的破损渗漏或通透性增加，胞内溶质外流入血液中[23]。谷草转氨酶和谷丙转氨酶主要存在于肝胰脏细胞中，是肝胰脏损伤的重要指示酶。可能是由于离水储藏中肝胰脏细胞造成损伤，从而使得肝胰脏中谷草转氨酶和谷丙转氨酶释放到血液中，导致试验鲫鱼血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶活力随着储藏时间延长及储藏温度升高而增加。

3.2 回归结果分析

有序多分类回归研究的因变量是有序的而且是多分类的,例如考察药物对受试者作用，将效果区分为逐级递进，由无效、有效直至治愈。优势比为在其他条件不变的情况下，自变量每改变1个单位，事件发生比的变化率。优势比等于1，表示该因素对事件的发生不起作用；优势比大于1，表示该因素是危险因素；优势比小于1，表示该因素是保护因素[24]。

储藏温度、肝糖原及储藏时间的优势比大于1，表明随着储藏温度升高，储藏时间延长，离水储藏的鲫鱼复苏时间延长；肝糖原的含量较大，相应复苏时间延长。血清皮质醇优势比小于1，表明皮质醇含量高的鲫鱼其复苏时间较短。

各项参数的优势比中，储藏温度影响较大，其值表示每升高1 ℃鲫鱼复苏时间延长一个等级的几率增大1.42倍。储藏时间的优势比为1.09，其值表示储藏时间延长1 h，鲫鱼复苏时间延长一个等级的几率增大1.09倍。储藏温度储藏时间作为危险因素，其数值的升高导致复苏时间延长，即存活能力的下降。0 ℃储藏较其他两种储藏温度可以极大地提高鲫鱼离水储藏的存活能力。

肝糖原优势比为1.02，其值表示肝糖原的数值增加一个单位，鲫鱼复苏时间延长一个等级的几率增大1.02倍。皮质醇的结果显示，皮质醇的数值增加一个单位，鲫鱼复苏时间延长一个等级的几率变为0.83。皮质醇的水平升高同时肝胰脏糖原的消耗表明，鲫鱼在离水储藏过程需要维持一定的应激反应，同时减少生理功能的损伤，两者的结果显示，鲫鱼正常生理功能的稳定有助于提高其离水后的存活能力。