超高效液相色谱-串联质谱同时测定盐碱胁迫金银花中3种内源激素

李天雪 胡玉涛 韦笑

摘要：建立同时测定金银花中水杨酸（SA）、脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）的超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）方法，并应用于盐碱胁迫下的金银花分析。激素经异丙醇/甲酸溶液（99/1，体积分数）提取后，通过固相萃取（SPE）柱净化。色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流动相为0.1%甲酸溶 液- 乙腈;体积流量为0.4 mL/min;进样量为3 μL;质谱采用电喷雾离子源负离子模式（ESI-），多反应监测（MRM）进行测定。3种内源激素具有良好的线性关系（R2≥0.998），最低定量限均为0.5 μg/L，稳定性良好，提取回收率在 81.5%～93.8%之间，精密度的RSD值为2.7%～7.9%之间，该法快速可靠，可适用于其他植物中SA、ABA和JA的含量检测。利用该方法测定盐碱胁迫下金银花中的3种内源激素，比较分析它们在盐碱胁迫下的含量变化规律，为内源激素对植物的逆境调控机制提供研究基础。

关键词：金银花;盐碱胁迫;水杨酸;脱落酸;茉莉酸;定量;超高效液相色谱-串联质谱

中图分类号：S567.7+90.1   文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）11-0229-05

江苏省地处黄海之滨，沿海盐碱滩涂面积达到 0.76万km2，引种经济型耐盐植物，可更有效地开发利用盐碱滩涂土地资源。金银花是一种能耐盐碱、耐干旱的多年生灌木植物，此外，金银花作为一种常用中药，具有清热解毒、凉风散热、保肝利胆等作用，因有较高的观赏和药用价值，是理想的盐碱地经济植物[1]。盐碱胁迫对作物产量、植物幼苗生理特性有显著影响[2-6]，植物内源激素作为信号分子，在调节植物代谢以提高植物对逆境的抗性方面起着关键作用[7]，内源激素主要有水杨酸（salicylic acid，SA）、脱落酸（abscisic acid，ABA）、茉莉酸（jasmonic acid，JA），研究内源激素动态变化规律，可有助于金银花抗逆境机制的研究，为金银花在盐碱滩涂的大面积种植提供一定的技术参考。

ABA是在高等植物中含量较高的植物激素，与种子休眠、幼苗生长、叶子脱落、气孔运动等都有着密切的关联，同时也是主要的应激激素，以调控植物的抗逆反应[8-9]。SA和JA都是特定生育环境刺激下诱导产生的植物激素，SA是植物生长抑制剂，抑制顶端分生组织生长，促进侧枝生长，属于一种重要的调控植物抗逆反应的应激激素，研究表明，盐胁迫下，SA可促进根茎生长，增加植株的鲜质量[10-11]。JA是参与植物抗性反应的一种重要信号分子[12]，在调控植物种子萌发、胚胎发育、幼苗发育、果实成熟、叶片衰老等方面起着重要的作用，尤其在植物干旱、盐胁迫等逆境胁迫应答中作用更为明显[13-15]。各种激素相互协同参与调控植物的生理过程，因此，同时测定SA、ABA和JA含量对金银花植物生理、逆境发育和作物生产等领域的研究具有重要意义。

目前植物激素的检测方法主要包括酶联免疫（ELISA）法[16-17]、毛细管电泳法[18-19]、电化学生物传感器检测法[20]、气相色谱-质谱联用（GC-MS）法[21]、高效液相色谱（HPLC）法[22-25]、液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）法[8，26-29]。因超高效色谱分离技术的应用，加上质谱的精确性高、选择性强，超高液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）法被认为是测定内源植物激素最灵敏、可靠的方法[30]。本研究建立了UPLC-MS/MS法并用其同时检测金银花中SA、ABA和JA这3种内源植物激素，并用于盐碱胁迫下金银花样品的分析，研究结果将为植物内源激素的合理开发、金银花的高效培育提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

安捷伦1290 Infinity LC-6460 QqQ三重四级杆串联质谱仪，配有G4220A四元低压梯度泵和MassHunter Version B.04.00工作站（美国安捷伦科技公司）;Oasis HLB SPE柱（规格3 cc/60 mg，美国沃特世公司）;Visiprep 24TM DL固相萃取仪（美国Supelco公司）;Eppendorf 5427 R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）;氮吹仪N-WVAPTM 112（美国Organomation公司）。

标准品SA、ABA和内标阿魏酸由南通经纬生物科技有限公司提供，JA购自美國Sigma-Aldrich公司，纯度均≥99%;甲醇（Sigma公司）、乙腈（Merk公司）、甲酸（上海安谱公司）为色谱纯;超纯水经过Milli-Q系统纯化制备;其余试剂均为分析纯，购自国药集团。

1.2 仪器条件

色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流动相为0.1%甲酸溶液-乙腈，梯度洗脱：0～3 min，10%～40%乙腈;3～6 min，40%～60%乙腈;6～8 min，60%～80%乙腈;系统平衡3 min;体积流量 0.4 mL/min;柱温40 ℃;进样量3 μL。

质谱采用电喷雾负离子源（ESI-源），多反应监测模式（MRM）;驻留时间为50 ms;检测电压：3.5 kV;离子源温度：120 ℃;锥孔电压：220 V;脱溶剂温度：350 ℃;脱溶剂气体（N2）体积流量：8 L/min;鞘气流速：11 L/min。SA、ABA和JA检测离子的质核和碰撞电压分别是质荷比137→93，35 eV;质荷比263→153，15 eV和质荷比209→59，14 eV。MRM质谱图见图1。

1.3 样品处理

[8]蘇 适，李瑞航，郎丹莹，等. 用改进的SPE-LC-ESI-MS/MS法测定小麦叶片ABA含量[J]. 分子植物育种，2015，13（8）：1850-1856.

[9]侯升杰，朱 江，丁明玉. 液相色谱-电喷雾串联质谱法测定冬青芽中的脱落酸[J]. 分析试验室，2009，28（3）：96-98.

[10]Jayakannan M，Bose J，Babourina O，et al. Salicylic acid in plant salinity stress signalling and tolerance[J]. Plant Growth Regulation，2015，76（1）：25-40.

[11]Morad M，Sara S，Mohammad D，et al. Effect of salicylic acid on alleviation of salt stress on growth and some physiological traits of wheat[J]. International Journal of Biosciences，2013，3（2）：20-27.

[12]李梦莎，阎秀峰. 植物的环境信号分子茉莉酸及其生物学功能[J]. 生态学报，2014，34（23）：6779-6788.

[13]冯孟杰，徐 恒，张 华，等. 茉莉素调控植物生长发育的研究进展[J]. 植物生理学报，2015，51（4）：407-412.

[14]巫建华，贾思振，冯英娜，等. 茉莉酸合成关键酶基因FaOPR3调控草莓果实成熟[J]. 江苏农业学报，2016，32（5）：1148-1154.

[15]郭正兵，韩柏明，郭 强. 茉莉酸甲酯对高温胁迫、生物蚕食无花果幼苗的影响[J]. 江苏农业科学，2017，45（20）：138-143.

[16]Quarrie S A，Whitford P N，Appleford N E，et al. A monoclonal antibody to（S）-abscisic acid：its characterization and use in radioimmunoassay for measuring abscisic acid in crude extracts of cereal and lupin leaves[J]. Planta，1988，173（3）：330-339.

[17]Lovelli S，Scopa A，Perniola M，et al. Abscisic acid root and leaf concentration in relation to biomass partitioning in salinized tomato plants[J]. Journal of Plant Physiology，2012，169（3）：226-233.

[18]Liu X，Ma L，Lin Y W，et al. Determination of abscisic acid by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection[J]. Journal of Chromatography A，2003，1021（1/2）：209-213.

[19]Ross A R，Ambrose S J，Cutler A J，et al. Determination of endogenous and supplied deuterated abscisic acid in plant tissues by high-performance liquid chromatography-electro-spray ionization tandem mass spectrometry with multiple reaction monitoring[J]. Analytical Biochemistry，2004，329（2）：324-333.

[20]Li Q，Wang R Z，Huang Z G，et al. A novel impedance immunosensor based on O-phenylenediamine modified gold electrode to analyze abscisic acid[J]. Chinese Chemical Letters，2010，21（4）：472-475.

[21]Jia K，Feng X M，Liu K，et al. Development of a subcritical fluid extraction and GC-MS validation method for polychlorinated biphenyls （PCBs） in marine samples[J]. Journal of Chromatography B，2013，923（3）：37-42.

[22]Gupta V，Kumar M，Brahmbhatt H，et al. Simultaneous determination of different endogenetic plant growth regulators in common green seaweeds using dispersive liquid-liquid microextraction method[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2011，49（11）：1259-1263.

[23]赵晓菊，唐中华，郭晓瑞，等. 固相萃取富集-高效液相色谱法测定长春花中的3种内源激素[J]. 色谱，2006，24（5）：534-534.

[24]赵曼丽，杨迎春，杨世杰，等. 骆驼刺根状茎中3种植物激素的分离与含量测定[J]. 安徽农业科学，2012，40（14）：8092-8093，8164.

[25]王水良，王 平，王趁义. 固相萃取-高效液相色谱法测定马尾松组织中内源激素[J]. 分析科学学报，2010，26（5）：547-550.

[26]Pan X Q，Welti R，Wang X M. Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry[J]. Phytochemistry，2008，69（8）：1773-1781.

[27]刘雪梅，赵 鹏，徐继林，等. LC-MS同时测定大型海藻中9个植物激素[J]. 药物分析杂志，2012，32（10）：1747-1752.

[28]钟冬莲，丁 明，汤富彬，等. 高效液相色谱-串联质谱同时测定毛竹笋中4种内源性植物激素[J]. 分析化学，2013，41（11）：1739-1743.

[29]钟冬莲，任传义，李祖光，等. HPLC-MS/MS法同时测定马尾松松针中水杨酸和茉莉酸[J]. 分析试验室，2017，36（2）：164-167.

[30]Mueller M，Munne-Bosch S. Rapid and sensitive hormonal profiling of complex plant samples by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Plant Methods，2011，7（1）：37.

[31]郭菊梅，陳红刚，曹 瑞，等. 氯化钠浓度对黄芩幼苗生长情况及生理指标的影响[J]. 中国药房，2014，25（47）：4497-4499.

[32]US FDA. Guidance for industry：bioanalytical method validation[Z]. US FDA，2001.

[33]Ryu H，Cho Y G. Plant hormones in salt stress tolerance[J]. Journal of Plant Biology，2015，58（3）：147-155.

[34]Wang X Q，Ullah H，Jones A M，et al. G protein regulation of ion channels and abscisic acid signaling in Arabidopsis guard cells[J]. Science，2001，292（5524）：2070-2072.

[35]Li W Q，Yamaguchi S，Khan M A，et al. Roles of gibberellins and abscisic acid in regulating germination of suaeda salsa dimorphic seeds under salt stress[J]. Frontiers in Plant Science，2016，6（1）：1235.

[36]Kang D，Seo Y，Lee J D，et al. Jasmonic acid differentially affects growth，ion uptake and abscisic acid concentration in salt-tolerant and salt-sensitive rice cultivars[J]. Journal of Agronomy and Crop Science，2005，191（4）：273-282.

[37]Pedranzani H，Racagni G，Alemano S，et al. Salt tolerant tomato plants show increased levels of jasmonic acid[J]. Plant Growth Regulation，2003，41（2）：149-158.

[38]Chanjirakul K，Wang S Y，Wang C Y，et al. Effect of natural volatile compounds on antioxidant capacity and antioxidant enzymes in raspberries[J]. Postharvest Biology and Technology，2006，40（2）：106-115.