3株猕猴桃细菌性溃疡病致病菌的药剂室内毒力比较

王瑞 雷霁卿 查仕连

摘要：为了筛选猕猴桃细菌性溃疡病的有效防治药剂，采用抑菌圈法比较28种杀菌剂对不同猕猴桃细菌性溃疡病3株致病菌（PSA1、PSA2、PSA3）的室内毒力，并测定药剂间复配对致病菌的联合毒力。结果表明，28种杀菌剂中20%溴硝醇、20%叶枯唑、40%百菌清3种杀菌剂对PSA1的毒力效果较强，其EC50值分别为32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于对照药剂72%硫酸链霉素（对PSA1的毒力效果EC50值分别为44.56、54.56、77.82 mg/L）的毒力效果;而40%百菌清对PSA2和PSA3表现出较好的毒力作用，其EC50值分别为53.21、54.45 mg/L，优于对照药剂硫酸链霉素。不同比例复配药剂的室内毒力筛选发现，20%溴硝醇+20%叶枯唑（质量比为3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（质量比为3 ∶ 1）2种复配剂对PSA1表现出较强的毒力，且为增效作用，均可作为田间猕猴桃细菌性溃疡病的有效防控药剂。

关键词：猕猴桃;溃疡病;杀菌剂;毒力测试;联合毒力

中图分类号： S482.2  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）11-0141-03

猕猴桃是猕猴桃科（Actinidiaceae）猕猴桃属（Actinidia）多年生藤木植物，别称毛桃、羊桃、奇异果（Kiwifruit）[1]，其果实含有大量的维生素、黄体素、氨基酸和天然肌醇，素有“水果之王”的美誉;此外，猕猴桃的根具有清热解毒、活血散结、祛风利湿等功效[2]。近年来，世界范围猕猴桃产业得到了持续发展，种植面积逐年增加，然而随着生产规模逐渐扩大，管理不科学，导致猕猴桃病害问题日益突出，其中猕猴桃细菌性溃疡病是一种严重威胁猕猴桃产业健康发展的重要病害，已成为制约猕猴桃产量的毁灭性因素，该病害的致病菌已确认为丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv.actinidia）[3-8]，其主要危害猕猴桃树的枝干、叶片和花，枝干受害后形成黄褐色或锈红色的局部溃疡腐烂，影响养分的输送和吸收，造成树势衰弱，严重时可环绕茎杆引起树体死亡。因此，对猕猴桃溃疡病的防控进行深入研究，寻求有效的病害防控药剂和方法是猕猴桃产业健康发展的重要保障。

目前，国内外对于该病害的药剂防治主要依赖于铜制剂和农用链霉素，长期单一使用该类药剂易使病原菌产生较强的抗药性，从而导致防治效果下降[9]。采用合理的化学药剂复配使用既可以提高防效、擴大防治谱的效果，又可以有效延缓病原菌的抗药性，同时还可以降低田间病害的防控成本[10]。针对这一目的，笔者所在课题组前期发现乙蒜素、溴硝醇、代森锰锌3种农药在室内毒力和田间防治中效果较好[11-12]。为了筛选出更好的猕猴桃溃疡病致病菌防控药剂，在前期工作的基础上，本研究分别从贵州省贵阳市修文县1个贵长猕猴桃果园、贵州省贵阳市乌当区偏坡乡2个红阳猕猴桃果园猕猴桃植株患处分离、纯化获得3株丁香假单胞杆菌属菌株，同时筛选了28种抗菌剂单剂对3株致病菌的室内毒力，并筛选了不同比例复配药剂的室内毒力，为猕猴桃种植业中溃疡病的综合防控提供长效、高效药剂基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 参照文献[13-14]的方法，于2016年3—4月分别从修文县谷堡乡1个贵长猕猴桃果园、贵阳市乌当区偏坡乡2个红阳猕猴桃果园采集感病植株染病部位，于贵阳学院食品与制药工程学院实验室采用稀释划线法，分离纯化得到溃疡病发病部位细菌，经菌落PCR、美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因库Blast比对，获得高同源性序列，分别与Pseudomonas sp. J3.1C9、Pseudomonas sp. SR64、Pseudomonas sp. WXBSY5同源性达99%，3株菌种属于均丁香假单胞杆菌属，分别命名为PSA1、PSA2、PSA3。

1.1.2 供试药剂 20%溴硝醇可湿性粉剂（丹东市农药总厂）;20%叶枯唑粉剂（山东拜耳化工有限公司）;80%多菌灵粉剂（英国邦农达农用化学品有限公司）;40%己唑醇悬浮剂（西安北农华农作物保护有限公司）;75%抑霉唑硫酸盐粒剂、50%克菌丹粉剂（安道麦马克西姆有限公司）;3%甲霜·霉灵水剂（天津市绿亨化工有限公司）;50%异菌脲粉剂[富美实（中国）投资有限公司];20%噻菌铜悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司）、50%氯溴异氰尿酸粉剂（南京南农农药科技发展有限公司）;60%唑醚·代森联散粒剂、60%唑醚·代森联散粒剂（青岛奥迪斯生物科技有限公司）;75%三环唑粉剂（上海锐联化工有限公司）;12.5%四氟醚唑水乳剂、70%甲基硫菌灵粉剂、41%甲硫戊唑醇悬浮剂（江苏龙灯化学有限公司）;80%代森锰锌粉剂（美国陶氏益农公司）;50%咪鲜胺锰盐可湿性粉剂（江苏省苏州富美实植物保护剂有限公司）;37%苯醚甲环唑散粒剂（山东海讯生物化学有限公司）;80%烯酰吗啉散粒剂（江西禾益化工股份有限公司）;70%氟环唑散粒剂、430 g/L戊唑醇悬浮剂、60%嘧菌酯散粒剂（北京华戎生物激素厂）;50%硫磺·多菌灵粉剂（江苏蓝丰生物化工股份有限公司）;26%嘧胺·乙霉威散粒剂（青岛瀚生生物科技股份有限公司）;40%百菌清悬浮（日本横滨工厂）;5%烯效唑粉剂（江苏剑牌农化股份有限公司）;3%噻霉酮粉剂（陕西西大华特科技实业有限公司）;对照药剂为72%硫酸链霉素（四川长征普惠生物工程有限公司）。

1.1.3 供试培养基 营养琼脂（NA）培养基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水定容至1 000 mL，调pH值为6.8～7.0，121 ℃湿热灭菌20 min备用。

1.2 试验方法

1.2.1 药剂处理 首先将28种药剂配制成1 000 mg/L的药液进行初筛，对于毒力较好的单剂和复配制剂均设置 1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 mg/L 6个浓度梯度（以有效成分计），每个浓度设3个平行，另设清水为空白对照，农用链霉素为阳性对照。

1.2.2 测定方法 参照文献[11，15]的方法，采用抑菌圈法测定28种单剂、复配剂对3株丁香假单胞杆菌的室内毒力。用无菌水配制含病原菌细胞106～107个/mL的菌悬液，每皿加入菌悬液1.0 mL，倒入至约10 mL、28 ℃的NA培养基，摇匀后制成平板。将直径为6 mm的灭菌滤纸片放入各药液内浸泡1 h，取出，放入平皿中，以无菌水浸泡滤纸为对照（CK），农用链霉素为阳性对照，置于28 ℃下培养，每个处理重复3次。48 h后观察，测量抑菌圈直径，计算抑制率，并以药剂浓度为横坐标、抑制率为纵坐标作回归方程，得到各药剂对猕猴桃溃疡致病菌的抑制中浓度（EC50）。

1.2.3 毒力指数及混剂共毒系数的计算 根据文献提出的方法[16-17]，选定试验中的一种农药为标准，计算出其余农药单用或混用的毒力指数（设其标准农药的毒力指数为100，毒力指数越大毒力越强）。

供试药剂的毒力指数=标准药剂的EC50供试药剂的EC50×100%;

混剂共毒系数=混剂实际毒力指数混剂理论毒力指数×100%;

混剂实力毒力指数=标准药剂的EC50混剂的EC50×100%。

混剂理论毒力指数=各单剂的毒力指数与其在混剂中含量的积的总和，共毒系数大于100为增效作用，等于100为相加作用，小于100为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 单剂的室内毒力

通过初步活性筛选，在浓度为1 000 mg/L的药液浓度下，28种供试药剂中有16种药剂对PSA1、PSA2和PSA3 3株丁香假单胞杆菌致病菌表现出抑菌作用，其中包括20%溴硝醇、20%叶枯唑、40%百菌清、3%甲霜·霉灵、3%噻霉酮、50%异菌脲、80%代森锰锌、40%己唑醇、50%克菌丹、20%噻菌铜、50%氯溴异氰尿酸、60%唑醚·代森联、80%多菌灵、70%甲基硫菌灵、5%烯效唑、75%三环唑;而50%咪鲜胺锰盐、37%苯醚甲环唑、80%烯酰吗啉、75%抑霉唑硫酸盐、60%嘧菌酯、50%硫磺·多菌灵、26%嘧胺·乙霉威、430 g/L戊唑醇、12.5%四氟醚唑、41%甲硫戊唑醇、70%氟环唑散粒剂、60%唑醚·代森联12种抗菌剂对PSA1、PSA2和PSA3 3株丁香假单胞杆菌致病菌均未显现出抑菌作用。由表1可知，20%溴硝醇、20%叶枯唑、40%百菌清3种杀菌剂对PSA1的毒力效果较强，其EC50值分别为32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于对照药剂72%硫酸链霉素（其对PSA1的毒力效果EC50值为44.56 mg/L）;而40%百菌清对PSA2和PSA3表现出较好的毒力作用，其EC50值分别为53.21、54.45 mg/L，优于对照药剂硫酸链霉素;其他药剂对PSA1、PSA2和PSA3的毒力效果EC50值均大于对照药剂，仅表现出较弱的毒力活性。

2.2 药剂复配的室内毒力

为了筛选出较理想的猕猴桃细菌性溃疡病防控药剂，测定20%溴硝醇、20%叶枯唑和40%百菌清不同复配比例药剂对PSA1的联合毒力，结果见表2。由表2可知，20%溴硝醇、20%叶枯唑和40%百菌清不同比例复配剂对PSA1的联合毒力存在较明显的差异，其中20%溴硝醇+20%叶枯唑（质量比为3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（质量比为3 ∶ 1）2种复配剂对PSA1的共毒系数较大，分别为159.31、173.50，表现出较好的增效作用;而20%溴硝醇+40%百菌清（质量比为1 ∶ 3）和20%叶枯唑+40%百菌清（质量比为1 ∶ 1）2种复配剂对PSA1表现出拮抗作用，其共毒系数分别为92.62、80.40;其余复配剂表现出加和作用，共毒系数大约为100。

3 结论与讨论

本试验以3株丁香假单胞杆菌属菌种PSA1、PSA2和PSA3为对象，采用抑菌圈法对28种杀菌剂进行室内毒力比较，发现20%溴硝醇、20%叶枯唑和40%百菌清对PSA1、PSA2和PSA3 3株致病菌表现出较好的毒力作用，其中20%溴硝醇、20%叶枯唑和40%百菌清对PSA1的毒力效果较强，其EC50值分别为32.56、43.12、44.06 mg/L，均小于对照药剂72%硫酸链霉素。进一步的复配药剂筛选发现20%溴硝 醇+20%叶枯唑（质量比为3 ∶ 1）和20%溴硝醇+40%百菌清（质量比为3 ∶ 1）2种复配剂对PSA1表现出较好的毒力效果，且表现出明显的增效作用。本研究为后续田间防控试验提供了重要药剂，有望在田间的实际应用中替代硫酸链霉素。由于田间发病的因素较为复杂，是多因素共同作用的结果[18]，本试验仅在室内筛选得到了较理想的防治药剂，但仍需通过田间试验得以证明，最终为贵阳市修文县、乌当区乃至贵州省猕猴桃大规模种植中心区猕猴桃潰疡病的综合防治提供科学依据。

参考文献：

[1]贾爱平，王 飞，张潮红，等. 中华猕猴桃品种间亲和性研究[J]. 园艺学报，2010，37（11）：1829-1835.

[2]吴怀恩，甄汉深，钟振国. 猕猴桃属植物的研究进展[J]. 中药材，2004，27（1）：59-63.

[3]Koh Y J，Kim G H，Jung J S，et al. Outbreak of bacterial canker on Hort16A （Actinidia chinensis Planchon） caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea[J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2010，38（4）：275-282.

[4]Dreo T，Pirc M，Ravnikar M，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in Slovenia[J]. Plant Disease，2011，95（95）：1311-1311.

[5]Everett K R，Taylor R K，Romberg M K，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing kiwifruit bacterial canker in New Zealand[J]. Australasian Plant Disease Notes，2011，6（1）：67-71.

[6]Abelleira A，López M M，Pealver J，et al. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Spain[J]. Plant Disease，2011，95（12）：1583.

[7]Liu Y，Li S J，Zhu T H，et al. Specific DNA markers for detection of bacterial canker of kiwifruit in Sichuan，China[J]. African Journal of Microbiology Research，2012，6（49）：7512-7519.

[8]Bastas K K，Karakaya A. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Turkey[J]. Plant Disease，2012，96（3）：452.

[9]高小宁，赵志博，黄其玲，等. 猕猴桃细菌性溃疡病研究进展[J]. 果树学报，2012，29（2）：262-268.

[10]吴乾守. 两种乙蒜素复配剂防治水稻稻瘟病的田间应用研究[J]. 福建稻麦科技，2007，25（2）：17-18.

[11]高蓬明，王 瑞，马立志. 猕猴桃溃疡病防治药剂的室内毒力及田间防治效果[J]. 贵州农业科学，2013，41（4）：85-88.

[12]王 瑞，马立志，高蓬明，等. 乙蒜素与溴硝醇、代森锰锌2种农药复配对丁香假单胞杆菌的联合毒力[J]. 江苏农业科学，2014，42（3）：71-73.

[13]方中达. 植病研究方法[M]. 3版.北京：中国农业出版社，1998.

[14]Mazzaglia A，Studholme D J，Taratufolo M C，et al. Pseudomonas syringae pv. actinidiae （PSA） isolates from recent bacterial canker of kiwifruit outbreaks belong to the same genetic lineage[J]. PLoS One，2012，7（5）：e36518.

[15]孫广宇，宗兆锋. 植物病理学实验技术[M]. 北京：中国农业出版社，2002.

[16]Sun Y P，Johnson E R. Analysis of joint action of insecticidesagainst house flies[J]. Journal of Economic Entomology，1960，53（5）：887-892.

[17]张瑞亭. 农药的混用与混剂[M]. 北京：化学工业出版社，1987.

[18]龙云川，彭 熙，李苇洁，等. 贵州猕猴桃溃疡病病菌分离鉴定及其培养特性[J]. 江苏农业科学，2017，45（20）：114-117.蒙 成，黄艳花. 玉米小斑病抗病鉴定接种培养基的产孢技术[J]. 江苏农业科学，2019，47（11）：144-147.