气相色谱-质谱对天然酿造酱油与配制酱油香气成分的分析比较

张凤英，胡继红，刘延岭，李俊儒，张彩，王静雯

(四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830)

酱油最早是从酱演变而来的，在周朝就有记载[1]，是我国传承已久的调料，随着酿造技术的发展和改进，其在全世界范围内都是各国餐桌上必不可少的调味品[2]。中国人常用的清淡调味的生抽、老抽；日本人喜欢的鲜鱼调配成的鱼露等[3-5]。进入21世纪，酱油在调味品中除了起到佐餐的作用，随着人们生活水平的提高，逐渐地加入了某些强化营养物质，形成了很多特种酱油如儿童酱油、铁强化酱油等[6，7]。在人们烹饪过程中，使得食材香味浓郁，满足人们的饮食需要，天然发酵的酿制酱油具有高盐稀态、低盐态、常温半固态酱油生产种类，酱油按照国标可以分为多个等级，氨基酸态氮含量最低都要超过0.4 g/dL[8]。在生产过程中会因发酵条件产生一些生物胺类物质如酪胺(对羟基苯乙胺)、组胺(不新鲜的鱼含量最多)等[9]，这两种物质都有刺激性，导致人体过敏，散发不悦的气味，大量使用会导致人体中毒，会对人体健康造成不利的影响，但都可以通过微生物强化改善酱油中这些生物胺类物质的含量[10]，减少不良气味，提高酱油风味。配制酱油在制作过程中，将酿造酱油进一步稀释，其中的营养价值较低。

根据 GB/T 18186—2000的定义，酿造酱油是由黄豆为主要原料，辅以少量小麦粉、麸皮或稻壳等其他原料经过米曲霉制曲、制醅、粗盐封池，经过微生物后期发酵，淋油产生具有特殊鲜、咸口感和特殊风味的酱油。SB 10336—2000中定义的配制酱油是指：产品中以酿造酱油为主要成分，向其中加入酸水解植物蛋白浆、再加入少量食品添加剂配制而成的液体调味品，其中以全氮含量为标准，酿造酱油的含量不得少于50%。配制酱油的口感和香气效果无法与酿造酱油相比，部分商家为谋取私利，将配制酱油改成酿造酱油标签，有些商家尽管标注配制酱油，但是质量参差不齐，找到对两种酱油进行鉴别的最佳方式指标是目前研究者努力的方向。《预包装食品通则》中对于产品标签有着严格的要求，如：必须注明使用转基因仍然没有比较明确的指标，有通过酱油感官状态、氨基酸态氮、氯丙醇和乙酰丙酸等物质的含量来区分酿造酱油和配制酱油的[11-14]。但不同制作工艺、手段都会导致这些物质含量出现浮动甚至可以通过化学手段降低或提高这些指标的含量，因此现有鉴别方法无法有效识别。本试验基于此，欲通过气相色谱-质谱法对两种类型的酱油进行分析，探讨香气成分，比较酱油质量，以期得到较准确的指标来判定酱油质量。

1 气相色谱-质谱试验

准备无水乙醚及无水硫酸钠等物质，将不同自然酿造工艺的酱油及配制酱油样品(避免污染)，利用GC-MS仪检测不同样品中的挥发性组分。

样品处理：在分液漏斗中加入150 mL酱油标本及等量的去离子水，再向其中添加100 mL重蒸无水乙醚，经过不少于2 h的连续萃取，乙醚相中会与酱油中大部分挥发性小分子物质互溶。萃取后的溶剂使用无水硫酸钠进行干燥处理后，在冰箱中冷冻1 d，将溶液进行过滤除去颗粒杂质，在40 ℃环境中，利用旋转蒸发仪将溶液中的乙醚溶剂去除，最终获取1 mL颜色略黄的液体。仪器设置：选用弹性石英毛细管色谱柱内径在0.25 mm，载气流速设定为0.6 mL/min，保持色谱柱的初始温度在40 ℃以上，初始时间为5 min，保持5 ℃/min的速度升温，最高温度设定在220 ℃，最高温度将持续15 min，实验过程无需分流处理，进样口温度保持在250 ℃，进样量为1 μL。质谱仪参数设定：离子源及电子能量保持在75 eV，发射电流为220 μA，设定电子倍增器压力值为360 V，离子源温度设定在210 ℃，对30～450 u范围进行质量检测。

2 试验结果

使用气相色谱-质谱仪对不同类型的自然酿造酱油和配制酱油中的挥发性成分进行测定后，对相关指标进行聚类分析统计，总体上看来，不同工艺酿制的酱油及配制酱油中具有不同的香气成分，但酿制酱油香气成分种类、单体物质更多；由图1的质谱图可知，3种自然酿造酱油化学物质中酚类物质，醇类物质、酸类物质含量较多，可以判定这些物质为自然酿造酱油中的主要香气成分，而挥发性组分中醇类含量最高。

图1 不同类型酱油挥发性物质比较Fig.1 Comparison of volatile compounds in different types of soy sauce

由图1可知，通过将不同挥发性组分图谱进行对照，以及通过标准物质对仪器进行校正，RSD(%)水平都在可靠的线性范围内，说明本次试验结果准确。邓岳等使用气质联用法对传统工艺的自然酿造酱油(样品选自非物质文化遗产——先市酱油)中的风味成分进行了测定，共检测出接近70种挥发性组分物质，包括醇、酸、酮、酯以及杂环类共计十大类化合物，对比本文的研究结果，先市酱油的酸类物质含量更高，醇类次之[15]。Zhao M M等采用气相色谱-质谱仪/嗅觉测定仪(GC-M/O)结合顶空-固相微萃取法(HS-SPME)对酱油的香气成分进行了分析,共分离了109种挥发性化合物，并用GC-MS进行了鉴定[16]。其中醇类含量最高(75.82%)，其次是醛、酯、酸和呋喃。其研究结果与本试验的结果比较符合，可以说明不同类型的自然酿造酱油可能和地域有关。试验将测定结果中主要的14种含量最多的物质进行罗列，见表1。

表1 不同加工工艺酱油挥发性香气成分气相色谱-质谱仪器分析结果Table 1 Analytical results of volatile aroma components of soy sauce by gas chromatography-mass spectrometry with different processing process

Feng Y等建立了一种以同时蒸馏萃取(SDE)和气相色谱法相结合的方法——质谱/嗅觉(GC-M/O)测定来分析酱油中的挥发性特征指纹图谱，其使用的萃取操作条件如下：100 mL酱油加100 mL饱和盐水、50 mL二氯甲烷萃取，确定了88种挥发性化合物。其中，由GC-O检测到26种芳香族活性化合物，包括3-(甲基硫)丙醛、2-甲氧基4-乙烯基酚、2-甲氧基酚、2-甲基丁烯酸、2,3-丁二酮、苯乙醛、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-甲基丁醛、2-甲基丁醛、3-甲基-1-丁醇2-甲基-1-丁醇(在高盐液态发酵酱油和低盐固态发酵酱油中均存在较高浓度[17]。这说明不同类型的自然酿造酱油生产工艺也会导致挥发性组分出现明显差异。

图2 不同类型酱油的主要挥发性化合物图谱Fig.2 Main volatile compounds graphs of different types of soy sauce

通过对不同种类型的酱油的质谱仪进行测定，对其中的醇、酚、醛、酮等化合物进行含量比较，见图2。酿造型酱油中醇含量最高，而配制酱油中由于使用酸水解蛋白会产生氯丙醇，因此不同品牌的配制酱油中都检测出少量的氯丙醇类物质(1,3-二氯丙二醇、3-一氯丙二醇)[18]。Crews C等设计并测试了一种新的自动顶空 GC-MS技术，用于分析酱油和类似产品中的1,3-二氯丙二醇(1,3-dcp)[19]。该方法结合了低温诱捕技术在40种酱油中的10个中检测到1,3-dcp，所有的都含有3-一氯丙二醇，这说明配制酱油中一个重要的指标体现在氯丙醇相关物质。Yanfang Z等使用高效液相色谱法对不同类型的酱油中游离氨基酸和挥发性化合物进行了分析，其检测出超过80种挥发性化合物，除了同本试验以及前面介绍的成果中的醇、酸、酯、醛、酮、酚、杂环化合物，还检测到痕量的炔烃和苯的同系物[20]。姬晓悦使用气质联用仪测定了4种不同品牌和类型的酱油(包括2种生抽和自然酿造酱油)，其共同特征是醇类、酯类和酚类物质为主要的挥发性组分，其研究结论同本试验结果相近[21]，本文使用气质联用仪测定不同类型酱油中的主要物质比例见表2。

表2 不同类型酱油香气化合物成分含量对比Table 2 Comparison of aromatic chemical composition content of different types of soy sauce

2.1 醇类化合物含量对比

醇类化合物香气成分，与酵母菌发酵作用存在主要的关系，醇类物质可经过化学反应后，转换为酯类物质，使人感受到浓郁香气，本试验测得的醇类物质总计检测11类，配制酱油只是酿造酱油的1/3，醇类化合物含量在化合物中占比最高，可散发出酒香。2-甲基丙醇及苯乙醇有花草及水果的香味，高献礼测定高盐稀态自然发酵酱油中确认了这两种化合物为主要的醇类挥发性物质[22]。甲硫基丙醇在酿造酱油中含量不足，但是在酱油中含有较强的挥发性，即使浓度较低，也能够散发较为强烈的肉汤或蘑菇(1-辛烯-3-醇)香气，这些化合物的存在使酱油具有特色香气。配制酱油中醇类物质含量不高，但与其中樟脑气味的丁醇的衍生物具有一定联系。酿造酱油在制作过程中香气浓郁，配制酱油将酿造酱油作为基础，成分勾兑后，较为不均，醇类物质香气不自然。

2.2 酚类化合物含量对比

酚类化合物可散发出酿造型酱油的典型香气，且鼻部细胞对酚类物质香气具有较强的敏感性，丰富的酚类物质可以使人感觉到酱油香气更加浓郁。4-乙基愈创木酚是豆酱、酱油中含量最多、最典型的挥发性组分，是酱油典型的标志性物质，在烹饪或者调味过程中，酱油受热挥发中会散发出一种独特的典型的咸、酱香气味 ，使得菜肴具有独特的口感，酚类是微生物通过复杂的作用机理，通过自然发酵方式形成的化合物，对酿造过程中加盐量进行调节，发现其在常温半固态酱油中占据较高的比例[23]，本试验检测的配制酱油中的酚类含量占比远低于3种酿造酱油。

2.3 醛酮化合物含量对比

醛、酮类化合物含量最多是在酱油发酵初期，高纯度、具有刺激性气味，而含有少量这类物质的酱油，在烹饪过程中具有调和作用。酮自身并非风味物质，但含量较少的羟基化合物会散发果味香气，或者表现为焦糖香气。熊芳媛等使用GC-MS测定酱油中香气成分发现，对老抽酱油香气贡献最大的风味物质是3,8-二羟基-2-甲基色酮，本试验中测定的酿造酱油中的主体香味为醇类以及典型的4-乙基-2-甲氧基苯酚[24]。姬晓悦测定的4种市售酱油中，醛类物质的比例同本试验结果相差不大，说明自然酿造的酱油挥发性物质比例相同。本试验测定的酿造酱油中检测出配制酱油中所不具备的香草醛，其在香草及土豆皮植物中存在，是香草豆散发香气的主体成分。

2.4 酸类化合物含量对比

酸类化合物在酱油发酵中占据重要地位，是耐盐乳酸菌主要的代谢产物[25]，是酱油风味中的主要物质，与其他物质反应后产生乙酸乙酯化合物，酱油经过后期的持续发酵，风味进一步提升。3种不同类型的自然酿造酱油的酸类物质含量具有明显差异性，配制酱油中酸类物质含量最低。

2.5 酯类化合物含量对比

自然酿造酱油中，曲霉及酵母菌在其中发挥着重要作用，氨基酸在经过复杂的化学反应后，与其他化合物进一步重合，组成新型有机物，主要类型为乙酸乙酯。利用气相色谱-质谱仪检测酿造酱油，结果显示有数量可观的酯类物质，配制酱油经过检测后，其中并未发现亚油酸乙酯及十六酸乙酯等化合物。此类物质的产生与豆类物质经过发酵后产生的物质存在联系，发酵后会产生一定的果味香气，保障酱油酿造后香气更加浓郁，具有协调感。

2.6 杂环类化合物含量对比

利用气相色谱-质谱仪检测不同生产工艺的酱油后，在其中观察到多种杂环类化合物，呋喃类化合物及糠醛在微生物作用下会产生一定的化学反应，使反应物产生谷物香气及咖啡香气，杂环类化合物的挥发性交叉，而糠醇是酿造酱油中的特殊香气成分，吡嗪化合物及二甲基吡咯化合物等成为酱油生产中的特殊物质，吡嗪化合物在生产过程中呈现烤香气味，配制酱油中虽然也有这些气味，但与焦糖色素存在联系。酿造酱油及配制酱油区分过程中，杂环类物质的检测较为重要。

3 结论

酿造酱油与配制酱油的鉴别是我国食品安全检测的重点方向，酱油是我国的传统调味品，在日常生活中具有重要地位，酱油不仅能够改善食物的风味和口感，而且有利于满足机体钾钠平衡。通过本试验对不同类型酱油的测定，结果表明：生产工艺不同，酿造酱油中主要挥发性组分物质含量不同，但因自然酿造的成品酱油发酵周期长导致风味物质含量均高于配制酱油中的同类化合物含量，酸类物质作为酿造酱油中的重要组分，是酱油香气中的重要物质，酿造酱油中酸类化合物含量明显高于配制酱油酸类物质含量。酿造酱油中含有特殊香气成分的乙醇及甲硫酸基丙醇、苯乙醇等，这些化学成分在配制酱油中无法被检测出，说明其中并未含有这些物质。本试验测定的不同地域和品牌酱油中的香气成分：低盐固态酿造酱油中含有双键的烯醇类物质等超过5种是其独有的；而高盐稀态发酵酱油中醇类物质及酯类物质含量较高，酚类及醛酮类、酸类、杂环类物质相对较少，有7种物质是高盐稀态发酵酱油所特有的。酿造酱油中含有的痕量或者独有的香气挥发性物质在配制酱油中相对较少甚至没有。配制酱油中含有大量的烤香味吡嗪化合物，与向其中增加一定量焦糖色素原料存在联系。经过试验测定，初步明确酿造酱油与配制酱油风味物质相关含量之间的关系，以及不同生产工艺，有利于鉴别不同类型酱油。