紫花苜蓿‖玉米间作对玉米氮代谢相关酶活性的影响

赵雅姣，刘晓静，童长春，吴 勇

(甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

豆科‖禾本科间作可以通过种间竞争提高豆科作物固氮能力，减少氮素的投入及降低土壤中硝酸盐含量等[1]，因此，不论是从资源利用方面还是对环境贡献等方面，豆科‖禾本科间作种植方式被研究者越来越重视[2]。豆科‖非豆科间作在发达国家已成为优质牧草生产的重要发展方向，有利于改善牧草的蛋白含量。有关多年生豆科牧草与一年生禾本科牧草间作的研究也较多。例如，三叶草(Trifoliumrepens)与黑麦草(Loliummultiflorum)和燕麦(Avenasativa)混种后获得营养平衡的饲草[3]；柱花草(Stybsanthesguianensis)与扭黄茅(Heteropogoncontortus)间作可提高单位面积牧草产量和禾本科牧草氮磷的吸收，有利于改善牧草品质[4]；紫花苜蓿(Medicagosativa)和玉米(Zeamays)间作下，经济产出大于单作紫花苜蓿和单作玉米[5]。玉米是需氮量较大的C4作物，适量的供氮有利于促进其叶绿体合成。玉米为须根系，将其与豆科植物间作会增加玉米根系水平和垂直尺度的生态位，增加玉米对氮素的吸收，减少氮的损失[6]。紫花苜蓿与玉米间作体系中玉米为优势种，因此其竞争养分能力较强，营养状况得到改善。玉米与紫花苜蓿的间作复合群体与单作群体比较，粗蛋白质和粗脂肪含量及鲜草和干草产量差异达到显著或极显著水平[7]。

氮素的吸收及利用与玉米体内氮代谢及氮代谢相关酶有密切关系。氮代谢为作物体内最基本代谢途径，其不仅影响作物的生长发育，而且也决定着作物产量和品质[8]。影响氮代谢的相关酶主要有硝酸还原酶(NR)、亚硝酸还原酶(NiR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合酶(GOGAT)。植物从土壤中吸收氮素后，通过NR、NiR、GS、GOGAT等的作用转运氮素到储藏器官中供植物生长发育的需要。NR和GS作为高等植物氮代谢途径中氮素初始同化中的关键酶，是一切无机氮素进入高等植物体内的“门户”，影响着植物氮素营养的吸收、同化及利用效率，对作物的生长发育、产量、品质等农艺性状具有决定性作用[9]。植物体中的氮素在氮代谢相关酶的催化作用下合成有机氮，成为蛋白质的重要组分。因此，植物的氮代谢产物及相关酶活性的变化，对牧草的产量及品质的高低及优劣起着重要调节作用[10]。有研究发现玉米花生间作能够提高玉米功能叶片的NR和GS活性，促进了无机氮向蛋白质转化[11]。王春丽[12]研究发现，间作玉米穗部叶片的NR活性受生长空间和资源竞争的改善比单作有所提高，豆科和禾本科间作下禾本科的氮吸收能力和氮代谢酶活性普遍高于单作[13]。为了探明玉米间作中氮素的高效利用，需对玉米本身氮代谢相关酶的变化规律进行认识[14]。目前，有关豆‖禾间作在粮食作物中的研究较多，而在牧草作物中的研究较少；间作对氮代谢差异的研究较多，而有关氮代谢酶活性在间作中的变化研究较少；间作对地上氮代谢差异研究较多，而对地下氮代谢差异研究较少。因此，通过根系分隔技术及玉米单作研究，地上互作和地下互作对玉米地上地下氮代谢产物及关键酶活性的影响，了解间作紫花苜蓿对玉米氮代谢产物及关键酶活性的变化规律及联系，揭示间作对禾本科作物氮代谢促进作用的实质，为该领域相关研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

紫花苜蓿为LW6010，由北京猛犸种业有限公司提供；玉米为KD-3，由河南省农业科学院提供；根瘤菌为中华根瘤菌12531，由甘肃农业大学提供。

1.2 试验设计

采用营养液砂培法于甘肃农业大学植物生长室中进行，材料种植于塑料桶中(直径32 cm，高20 cm)。试验设置2个氮素水平，4种种植方式，每个处理重复3次。2个氮素水平是(1)N21，低N水平，21 mg N/L，(2)N210，正常N水平(紫花苜蓿适宜氮水平)，210 mg N/L。N21和N210营养液均使用Hoagland-Arnon营养液为基本营养液，NO3--N∶NH4+-N的比例为1∶1。4种种植方式为(1)玉米单作，(2)紫花苜蓿‖玉米间作根系不分隔，简称不分隔(3)紫花苜蓿‖玉米间作根系尼龙网分隔，简称尼龙网分隔，(4)紫花苜蓿‖玉米间作塑料分隔，简称塑料分隔。玉米单作每桶留8株玉米，均匀种植于塑料桶中。不分隔、尼龙网分隔和塑料分隔每桶各留10株紫花苜蓿和4株玉米分别均匀种植于屏障的两侧。其中，根系分隔的种植方式参考李隆等[15]团队的相关研究。

紫花苜蓿2018年3月1日播种，玉米为2018年5月5日播种。试验设3个取样日期，2018年6月13日，6月28日和7月13日进行各指标的测定，紫花苜蓿的3个取样时期分为分枝期、现蕾期和初花期，而玉米分别为苗期、拔节期和孕穗期。在紫花苜蓿出苗后7 d，向桶中加入N营养液(每桶1 000 mL)，然后接种根瘤菌(每桶25 mL)，后每周更换1次营养液，共换17次营养液。取玉米植株功能叶片(穗位叶)及根尖部位进行氮代谢酶活性的测定。

1.3 测定指标

硝酸还原酶(NR)：采用邹琦[16]的方法，单位：μg/(g FW·h)。

亚硝酸还原酶(NIR)：参照Rajasekhar[17]的方法，单位：μg/(g·h)。

谷氨酰胺合成酶(GS)：参照邹琦[16]的方法，单位：μmol/(g FW ·h)。

谷氨酸合酶(GOGAT)：参考郑朝峰等[18]方法，单位：umol/(L·min)。

地上干物质重：采用烘干法测定。

地上氮积累量：采用半微量凯式定氮法测定全氮含量[19]，地上氮积累量为地上干物质重与地上氮含量的乘积。

1.4 数据分析

试验数据使用Excel 2007软件整理后，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(ANOVE)和pearson相关性分析(双侧检验)，并用LSD法进行差异显著性测验，显著性水平设定为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 玉米NO3-相关酶活性的变化

随着生育期的推进，玉米地上、地下的NR、NiR、GS和GOGAT活性均随着生育期的推进不断增加，并且其在不同种植方式下均表现为不分隔>尼龙网分隔>塑料分隔和玉米单作。玉米地上部和地下部的NR活性在不同氮素水平和不同种植方式下均差异极显著(P<0.01)(表1)。氮素水平×种植方式互作，除苗期玉米的地上部分NR活性差异极显著外(P<0.01)，其余均差异不显著。玉米地上部NR活性，在2个氮素水平下均表现为不分隔显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)；在N210水平下，塑料分隔和玉米单作差异不显著；而在N21水平下，塑料分隔显著大于玉米单作(P<0.05)。

玉米的NiR活性在氮素水平和种植方式下均表现为差异极显著(P<0.01)，氮素水平×种植方式互作在苗期的地下部分表现为差异显著(P<0.05)，而苗期的地上部、拔节期和孕穗期的地上部及地下部均表现为差异不显著(表2)。玉米的地上部NiR活性在N210和N21下均表现为不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于塑料分隔，显著大于玉米单作(P<0.05)。而玉米地下部NiR活性表现为不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于塑料分隔(P<0.05)。N21下，玉米地下部NiR活性在尼龙网分隔和塑料分隔下差异显著。

注：*和**表示差异显著和差异极显著，下同

表2 不同种植方式及氮素水平处理下玉米的NiR

2.2 玉米NH4+相关酶活性的变化

玉米地上部和地下部GS活性在氮素水平和种植方式下均表现为差异极显著(P<0.01)，而在氮素水平×种植方式互作下各时期GS活性均差异不显著(表3)。玉米地上部GS活性在N210下表现为不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于塑料分隔，显著大于玉米单作(P<0.05)。而玉米地上部GS活性在N21下表现为不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)，塑料分隔和玉米单作差异不显著。玉米地下部GS活性表现在N210和N21下均表现为不分隔显著大于尼龙分隔，显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)。其中，拔节期时塑料分隔和玉米单作差异不显著，而孕穗期时塑料分隔显著大于玉米单作(P<0.05)。

玉米GOGAT活性在氮素水平和种植方式下均表现为差异极显著(P<0.01)(表4)。玉米地上部GOGAT活性在拔节期和孕穗期时，氮素水平×种植方式互作差异极显著，而在地上部的苗期及地下部的各生育期均表现为差异显著(P<0.05)。玉米地上部GOGAT活性除苗期的N210水平，其余均表现为不分隔显著大于尼龙网分隔(P<0.05)。玉米地上部GOGAT活性在苗期和拔节期，塑料分隔和玉米单作差异均不显著，而孕穗期塑料分隔显著大于玉米单作(P<0.05)。玉米地下部GOGAT活性，在N210下不分隔均显著大于尼龙网分隔；而在N21下，苗期和拔节期不分隔和尼龙网分隔差异不显著，孕穗期不分隔显著大于尼龙网分隔(P<0.05)。玉米地下部GOGAT活性在2个氮素水平和各生育期时，塑料分隔和玉米单作差异均不显著。

表3 不同种植方式及氮素水平处理下玉米的GS

表4 不同种植方式及氮素水平处理下玉米的GOGAT

2.3 玉米干物质重的变化

玉米干物质重随生育期的推进而增大，苗期到拔节期的增长速度较小，而拔节期到孕穗期的增长速度较大。玉米地上地下干物质重在各分隔方式中表现为不分隔>尼龙网分隔>塑料分隔>玉米单作。其中，玉米地上干物质重在N210和N21下，苗期时，各种植方式间均差异不显著；拔节期时，不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于玉米单作(P<0.05)，塑料分隔和玉米单作差异不显著；孕穗期时，不分隔显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)，塑料分隔和玉米单作差异不显著。玉米地下干物质重在2个氮素水平和各生育期下表现为不分隔显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)，不分隔和尼龙网分隔差异不显著，塑料分隔和玉米单作差异不显著(图1)。

2.4 玉米氮含量的变化

不同种植方式玉米氮含量随着生育期的推进而不断下降(图2)。玉米氮含量在各种植方式下的变化规律与干物质重的变化规律相似，均为不分隔>尼龙网分隔>塑料分隔>玉米单作。玉米地上氮含量在N210下，苗期时不分隔显著大于玉米单作(P<0.05)，而与尼龙网分隔和塑料分隔差异不显著；拔节期和孕穗期时，不分隔显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)，而不分隔和尼龙网分隔、塑料分隔和玉米单作差异不显著。玉米地上部氮含量在N21下，各生育期均表现为不分隔显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)。玉米地下部氮含量在N210和N21下，各生育期的不分隔时显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)；苗期和孕穗期时不分隔显著大于尼龙网分隔(P<0.05)，而在拔节期时不分隔与尼龙网分隔差异不显著。

图1 不同种植方式及氮水平处理下玉米的干物质Fig.1 Effect of different cropping patterns and nitrogen levels on dry matter yield of maize

图2 不同种植方式及氮水平处理下玉米的氮含量Fig.2 Effect of different cropping patterns and nitrogen levels on N content of maize

2.4 玉米氮积累量的变化

玉米氮积累量随生育期的推进不断增大。玉米地上氮积累量除苗期的N210水平外，其余均表现为不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)，塑料分隔和玉米单作差异不显著。玉米地下部氮积累量在N210和N21下，苗期和孕穗期表现为不分隔显著大于尼龙网分隔，显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)；而在拔节期不分隔显著大于塑料分隔和玉米单作(P<0.05)，不分隔和尼龙网分隔差异不显著(图3)。

图3 不同种植方式及氮水平处理下玉米的氮积累量Fig.3 Effect of different cropping patterns and nitrogen levels on N accumulation of maize

3 讨论

NR、NiR、GS、GOGAT是从无机氮变为有机氮过程中最重要氮代谢相关酶[20]。玉米地上部、地下部NR、NiR、GS和GOGAT活性在不同生育期和氮素水平下均表现为不分隔>尼龙网分隔>塑料分隔≥玉米单作。在3种分隔方式中，不分隔、尼龙网分隔和塑料分隔无地上互作差异，而有地下互作差异，而出现4种氮代谢相关酶活性在3种分隔方式下的活性不同是由于玉米与紫花苜蓿地下互作的强度不一样，因而玉米对氮素的竞争也不一样，从而导致氮代谢相关酶活性的差异。不分隔时，玉米和紫花苜蓿根部相互交叉重叠，从而增大了玉米对紫花苜蓿氮素的竞争；而尼龙网分隔时，两种作物的根系无相互交叉重叠，但玉米依然可以竞争紫花苜蓿周围的氮素，然而其在尼龙网分隔时的竞争能力弱于其在不分隔时的竞争能力；而玉米在塑料分隔时，玉米无法竞争紫花苜蓿根系的氮素。因此，玉米的4种氮代谢相关酶活性在不分隔时竞争到的氮素高于尼龙网分隔，塑料分隔。而氮代谢相关酶活性主要受氮浓度的影响[21]，刘胜波[22]研究表明，NR活性与其底物的氮素浓度呈正相关；其他研究学者也证实NR和GS活性随氮浓度的增高而增高[23-26]；研究中，不同种植模式下正常氮处理的玉米氮代谢相关酶活性均高于低氮处理，进一步证明提高氮素水平有利于提高玉米氮代谢相关酶活性。因此，得出紫花苜蓿与玉米根系互作越紧密，玉米对氮素的竞争越大，玉米氮含量越高，其氮代谢酶活性也越大。唐秀梅等[27]对木薯‖花生间作研究发现，间作下木薯叶片NR和GS活性显著增加，并且根系间的相互作用越大其NR和GS活性越高，说明两种作物互作提高了NR和GS活性，这与本研究结果一致。

玉米的4种氮代谢相关酶活性在塑料分隔时大于玉米单作，主要是由于地上互作引起的。玉米在塑料分隔和单作时，均与紫花苜蓿无地下互作，而塑料分隔时玉米与紫花苜蓿有地上互作，玉米作为高位作物可以获得更多的光照，并可以加快碳水化合物和氮代谢产物的转化，因而提高氮代谢相关酶活性；而玉米单作时，地上部无光合优势。因此，玉米4种氮代谢相关酶活性也受地上条件的影响，从而表现为塑料分隔大于玉米单作。关义新等[28]研究报道弱光下玉米幼苗叶片中NR活性较低，不利于植株的氮同化作用。全晓艳[29]研究报道弱光下水稻籽粒GS活性低于正常光照下的，且遮光程度越大，酶活性越低，不利于植株对氮素的吸收和同化。试验中玉米不同氮代谢相关酶活性在不分隔和尼龙网分隔时均显著大于塑料分隔和单作，而塑料分隔与单作之间的差异较小。孕穗期时，NR的地下部、GS的地下部和GOGAT的地上部在塑料分隔下显著大于玉米单作，说明氮代谢的酶活性随生育期的增加，其差距也在增加。由此可见，地下互作对氮代谢相关酶活性的影响程度较大，不分隔可增加作物根系对土壤养分的吸收，进而提高作物的氮代谢水平，同时提高了作物的氮代谢相关酶活性，加速了蛋白质的合成，提高了氮含量和氮积累量；而地上互作对氮代谢相关酶活性的影响相对较小，但由于玉米与紫花苜蓿株高间差距不断增大，其影响也逐渐增大。宋航也有类似研究，即遮光使玉米穗位叶NR和GS活性降低；而增氮肥使玉米NR和GS活性升高；弱光下随施氮量增加玉米的NR和GS活性同样增强[30]。

玉米的地上部和地下部的干物质重、氮含量和氮积累量在不同氮水平和种植方式下的表现与4种氮代谢相关酶一致。表明氮代谢相关酶活性的增高有利于提高作物的生物量及氮积累量，这是由于氮代谢产物的形成与4种氮代谢相关酶对氮素的转化途径有关，并且NR与NiR之间，GS与GOGAT之间均具有耦合关系。秦永梅等[31]研究报道，GS活性的变化趋势与NR活性基本相似，进一步说明了该2种酶共同完成氮同化途径。并且，由于玉米在间作体系中表现出较强的竞争能力，玉米在不分隔时根系可以有效地促进紫花苜蓿地根瘤固氮，因而吸收利用较多的氮素，提高体内氮素含量，从而促进氮代谢相关酶的活性，最终增加其生物量及氮积累量。不同种植模式中正常氮处理时玉米氮代谢产物均高于低氮处理，这与氮代谢相关酶活性在2个氮水平下的表现也一样，说明氮代谢相关酶活性与氮代谢产物有着密切的关系。肖焱波等[32]报道了小麦与蚕豆间作中含氮量，发现小麦含氮量在不分隔时最高，根系相互作用改善了小麦生长。因此，可以得到，玉米的氮代谢相关酶活性可以直接反应其氮代谢的能力。

4 结论

紫花苜蓿‖玉米在不同氮素水平及不同种植方式下，其氮代谢相关酶活性及氮代谢产物均表现为常氮水平>低氮水平，不分隔>尼龙网分隔大于塑料分隔和玉米单作。因此，紫花苜蓿‖玉米间作可以提高玉米氮代谢相关酶活性以及氮代谢产物的积累。说明紫花苜蓿‖玉米中根系互作越紧密、氮素浓度越高，越有利于玉米的氮代谢相关酶活性的提高以及氮代谢产物的积累；氮代谢相关酶活性可以直接反应其氮代谢的能力。