邻苯二甲酸二甲酯对荧光假单胞菌的损伤研究

郭茹鑫，王志刚*，王春龙，由义敏，王恒煦

（1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006；2.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240）

邻苯二甲酸二甲酯（Dimethyl phthalate，DMP）是一类被广泛应用的人工合成有机化合物[1]。DMP对生物体具有致畸、致癌、致突变的性质，因此已被美国环保署及中国环境保护局列为优先控制污染物[2]。DMP与聚合物通过非共价键结合，因此很容易渗透到环境当中。到目前为止，土壤[3]、大气[4]、水环境[5]均已检测出DMP，可见其污染的广泛性。汕头蔬菜产区土壤样品中DMP的含量已超过美国土壤优先控制标准，超标率为38.1%[6]；青岛市两种土壤中DMP的浓度分别为 0.07 mg·L-1和 0.04 mg·L-1[7]；天津大气 PM10样品中DMP占总肽酸酯含量的0.72%～6.72%[8]；黄河兰州断面[9]水体中DMP最高检测浓度为6.3×10-2mg·L-1；青岛海岸带表层沉积物中DMP的浓度范围为1.7×10-3～9.5×10-2mg·L-1[10]。

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一类广泛分布于自然界的革兰氏阴性菌，可作为植物抗病菌，其产生的挥发性化合物、硝吡咯菌素等抗生素可抵抗病原真菌对植物造成的病害[11-12]；又可作为植物根际促生菌，促进植物更好地吸收营养物质，同时还能产生各种酶和代谢物用以抵抗各种生物和非生物的胁迫[13-14]。

有研究指出DMP污染改变了土壤中微生物的代谢活性和功能多样性，增加了与氮素代谢有关的某些菌属的百分比，从而使土壤有益菌属的百分比降低，对土壤环境产生了不良影响[3，15-17]。DMP污染严重抑制了黑土中P.fluorescens的生长[3]，但DMP对细菌细胞的毒理作用尚不清楚。因此，本试验以DMP与P.fluorescens为研究对象，探讨DMP污染对P.fluorescens细胞的损伤机制，为探究DMP生态毒理效应和生物修复技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试剂

P.fluorescens ATCC13525由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供。

牛肉膏蛋白胨培养基：3 g牛肉膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl和1 L双蒸水，pH 7.0。加入不同量的DMP，使DMP的终浓度分别为0、10、20、40 mg·L-1。

实验所用主要试剂如表1所示。

表1 试验试剂Table 1 Test reagents

1.2 实验方法

1.2.1 细菌培养

P.fluorescens 30 ℃，130 r·min-1过夜培养，将细菌培养液按1%的接种量分别接种到含有0、10、20、40 mg·L-1DMP的100 mL灭菌牛肉膏蛋白胨培养基中。以不加DMP的处理为对照组（CK），10、20、40 mg·L-1DMP浓度为实验组。30 °C，130 r·min-1振荡培养细菌至对数生长中期（8 h），进行试验。

1.2.2 平板计数试验

分别取1 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）条件下培养5 h和8 h的细菌，再分别将其加入装有9 mL灭菌的去离子水试管中，依次进行浓度稀释，最终取稀释度为108和109的菌悬液100 μL进行平板涂布试验，根据对数生长的数学模型计算细菌比生长速率与代时和DMP污染浓度的相互关系。比生长速率（μ）和代时（G）公式如下：

式中：Nt和N0分别代表时间8 h和5 h时的细胞数量。

1.2.3 细菌表面Zeta电位试验

取 5 mL在不同浓度 DMP（0、10、20、40 mg·L-1）条件下培养8 h的P.fluorescens，于 4000 r·min-1离心10 min，收集菌体，用灭菌的去离子水清洗并且重悬，制备成终浓度为OD600=0.8的菌悬液。利用Zeta电位仪测定细菌表面电位[18]。

1.2.4 细菌膜流动性试验

取10 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）条件下培养8 h的P.fluorescens，于 4000 r·min-1离心10 min，弃上清，用灭菌的去离子水清洗并且重悬，制备成终浓度OD600=0.8的菌悬液。加入新配制的100 μmol·L-1的DPH四氢呋喃溶液5 –L，室温避光染色细菌30 min，得到DPH标记的细菌。再利用带有偏振装置的荧光分光光度计测定荧光偏振度P。检测条件：激发波长Ex=360 nm；发射波长Ex=427 nm；激发狭缝5 nm；发射狭缝10 nm[19]。

1.2.5 透射电镜（TEM）试验

取1.5 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）条件下培养8 h的P.fluorescens，用灭菌的去离子水清洗并且重悬。取菌悬液100–L于锡箔纸上，自然风干后分别在2.5%戊二醛与1%锇酸中于4℃下固定4 h，然后用30%、50%、70%、85%和95%的乙醇梯度脱水，再经100%乙醇脱水2次，脱水后冻干。将冻干的样品经Eponate 812环氧树脂包埋，超薄切片（70 nm左右）后，经醋酸铀-柠檬酸铅双染，透射电子显微镜观察菌体表面形态变化[20]。

1.2.6 DMP在P.fluorescens细胞内外的分布

取10 mL在不同浓度DMP（0、10、20、40 mg·L-1）条件下培养8 h的P.fluorescens，4000 r·min-1离心 10 min，收集上清液于干净的试管中，再加入5 mL灭菌的去离子水洗涤一次，将上清液与试管中的溶液合并，用于测定细胞外DMP浓度；剩余沉淀细菌加5 mL灭菌的去离子水重悬，通过超声波细胞粉碎机破碎细胞，11 000 r·min-1离心10 min后收集上清液，用以测定细胞内DMP浓度[21]。每个样品分别用相同体积的乙酸乙酯萃取，取上层有机相于旋转蒸发仪中蒸干，再用色谱级甲醇定容至10 mL，取1 mL溶液置于液相小瓶中，通过高效液相色谱检测其中的DMP含量。检测条件为流动相：90%甲醇，10%水；柱温：30℃；流速：0.5 mL·min-1；检测波长228 nm[22]。

1.3 数据处理

所有实验均进行3次平行处理，实验数据以平均值±标准差表示，数据采用SigmaPlot 12.5进行图表绘制，SPSS 22.0软件进行统计分析，P＜0.05具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 P.fluorescens比生长速率与代时和污染浓度的关系

对数生长的数学模型在现代微生物学中的应用越来越重要，它能较明确地表达生命现象的动态过程。如图1A所示，与CK相比，随着DMP污染浓度增加，比生长速率逐渐减小，说明DMP污染浓度越大，细菌每小时增加的数量越少，即生长速度缓慢。从图1B可以看出，随着DMP污染浓度增加，代时（每个细菌分裂繁殖一代所需的时间）越长。此试验表明随着DMP污染浓度增加，细菌个体繁殖速度迟缓且生长速率缓慢。这与Wang等[23]研究表明较大的DMP浓度对P.fluorescens的生长和葡萄糖的利用有很大抑制作用的结果一致。

图1 P.fluorescens在不同浓度DMP处理下的比生长速率（A）及代时（B）Figure 1 The specific growth rate（A）and generation time（B）of P.fluorescens treated with different concentrations of DMP

2.2 P.fluorescens表面Zeta电位变化

细胞壁是细菌的重要结构，同时也是保护细胞免受外界损伤的第一层保障[24]。P.fluorescens表面Zeta电位变化如图2所示，CK的表面电势为-12.21±0.56 mV。随DMP污染浓度增加，细菌表面Zeta电位逐渐减小，最低为-18.13±0.67 mV。细菌含有独特的细胞壁结构，包括肽链和氨基糖链组成的肽聚糖及其他蛋白质、多糖类物质，这是细菌表面带有负电荷的原因。Liu等[18]用低浓度全氟辛烷磺酸和全氟辛酸处理大肠杆菌后细菌表面Zeta电位降低，与本研究结果一致。可能是细菌免疫产生蛋白和脂多糖以减少自身损伤的结果，或由于细胞内电荷的内容物流出，附着在细菌表面，降低细胞表面所带的负电荷，导致Zeta电位的减小[25]。DMP对P.fluorescens的毒理作用机制，在微观上首先表现为DMP对细菌细胞壁结构的破坏。

图2 P.fluorescens表面Zeta电位变化Figure 2 Changes of Zeta potential on the surface of P.fluorescens

2.3 P.fluorescens膜流动性变化

生物细胞膜是细胞与外界环境之间的重要屏障，可维持细胞的基本代谢，保护细胞免受外界干扰，其中流动性是维持细胞膜发挥正常功能的关键。疏水性荧光探针DPH已经被广泛用于细胞膜流动性的研究，DPH荧光偏振度与目标生物膜的流动性密切相关：膜流动性增加会降低荧光偏振度P，反之亦然[26-28]。如图3所示，经DMP污染后，P.fluorescens细胞膜流动性明显改变，随着DMP处理浓度的增加，DPH的荧光偏振度从0.194逐渐降低到0.174，细胞膜流动性显著增加。膜流动性的增加可能会破坏细菌细胞的结构，导致细胞质壁分离，同时细胞内含物会暴露在外部环境中，这也可能是电负性下降的原因[18]。有报道称化合物全氟辛烷磺酸、蒎烯和四氢萘也会引起细菌细胞膜流动性增加[29-30]，因此我们猜测P.fluorescens膜流动性的增加可能是因为DMP导致细菌的脂肪酸链排列松散，破坏细菌的脂双层结构，进而影响膜的功能[19]。

图3 P.fluorescens膜荧光偏振度变化Figure 3 Changes of fluorescence polarization on membrane of P.fluorescens

2.4 TEM电镜观察

TEM电镜观察结果如图4所示，可以看出未经DMP污染的P.fluorescens纵切面细胞壁和细胞膜完整；横切面表面光滑，无明显变形。而DMP污染后，P.fluorescens纵表面出现明显的质壁分离、表面褶皱（黑色箭头）；横切面凹凸变形明显（白色箭头）；同时出现了某些细胞内容物的释放（白色圆圈）。TEM图明显说明了P.fluorescens受到DMP污染后，细胞壁和细胞膜遭到破坏。

图4 P.fluorescens的TEM图（×50 000倍）Figure 4 TEM images of P.fluorescens（×50 000 times）

2.5 DMP在P.fluorescens细胞内外分布

赵晓松等[31]发现DMP可以与DNA进行嵌插性的结合，改变DNA的结构。王志刚等[32]研究发现DMP污染会抑制Bacillus subtilis B19、Escherichia coli K12生长，对细菌产生氧化损伤，引起细菌氧化应激。DMP在P.fluorescens细胞内外的分布见图5。由图可知，培养基中的DMP浓度随着DMP添加量的增加而增加。在DMP处理浓度为40 mg·L-1时，培养基中的DMP检测值达到最大，检测浓度为30.52±0.88 mg·L-1。从图中还可以看出，在10、20、40 mg·L-1DMP浓度处理下的P.fluorescens细胞内检测到的DMP浓度越来越高，从 0.11±0.10 mg·L-1升高到了 6.78±0.25 mg·L-1。这说明当P.fluorescens受到DMP污染时，DMP会破坏细胞壁和细胞膜后进入到细胞内，并且随着DMP浓度的增加，细胞壁和细胞膜的破坏程度越大，进入细胞内的DMP浓度越高。

图5 DMP在细胞内外含量Figure 5 DMP content inside and outside the cell

3 结论

（1）DMP污染P.fluorescens，导致细菌细胞膜特性改变，其中膜流动性、通透性增加，同时也导致细胞壁表面电位降低，细胞内容物泄露。

（2）DMP污染导致了P.fluorescens比生长速率减小，代时增加。

（3）DMP可以破坏P.fluorescens的细胞壁和细胞膜后渗透进入细菌内，影响细菌正常生长。