长期氮添加对东北地区兴安落叶松人工林土壤酶的影响

马鹏宇 张红光 昝 鹏 顾伟平 温璐宁 张子嘉 翁海龙 孙 涛 毛子军*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 2.东北林业大学帽儿山实验林场，尚志 150611； 3.中国科学院森林生态与管理重点实验室(沈阳应用生态研究所)，沈阳 110016； 4.黑龙江丰林国家级自然保护区管理局，五营 153033)

氮元素作为物质循环中的一个重要组成部分，影响着森林生态系统的物质循环与能量流动。氮沉降问题开始于工业化较早的欧洲和北美地区，自两次工业革命后，人类发现化石燃料并大量使用，向大气中排放氮化物的量远远高于工业革命前[1]，形成“氮饱和”[2]。大气氮沉降量上升，已成为许多森林生态系统的重要生态因子[3]。顾峰雪[4]的研究结果表明，随着中国工业化水平的提高，氮沉降量由20世纪60年代的0.31 g·N·m-2·a-1增加到21世纪初的1.71 g·N·m-2·a-1，年增长率为0.04 g·N·m-2·a-1。日益严重的氮沉降影响着陆地生态系统初级生产和分解间的动态平衡关系[5]。分解过程是生态系统中的关键性过程，在诸多控制因素中土壤分解酶起着关键性作用[6]。长期氮沉降下的土壤酶活性变化相关研究集中于华南和华西地区，关于东北地区的相关研究甚少，在一定程度上制约了我国土壤酶的研究进展。

土壤酶作为土壤的重要组成成分，其活性可以表示土壤管理系统的效果。土壤酶在植物根系和微生物残体上产生，与土壤有机、无机成分结合在一起，作为催化剂参与土壤的生物化学反应与物质循环[7]。近年来，众多研究表明大气氮沉降引起土壤中氮化合物的积累，导致土壤结构变换，对土壤酶活性产生显著影响[8]。但在不同的生态系统中，土壤酶活性对氮沉降的响应有所不同，例如Sinsabaugh R L.等研究发现糖槭林中添加无机氮氧化酶活性增强，但在红栎林中却降低[9]。国内的相关研究结果也有差异，涂利华等在华西雨屏区的研究发现在苦竹林中添加无机氮土壤氧化酶活性增强[10]，但在光皮桦林中降低[11]。因此氮沉降对森林土壤酶活性的影响有必要结合具体环境进行研究。

本研究以东北地区造林最多的兴安落叶松(Larixgmelinii(Rupr.) Rupr.)人工林为研究对象，研究土壤中与碳、氮和磷元素循环相关的水解酶，包括β-1,4-糖苷酶(BG)、纤维素二糖水解酶(CBH)、亮氨酸氨基肽酶(LAP)和酸性磷酸酶(AP)；与腐殖质形成相关的氧化酶，包括过氧化物酶(PER)和多酚氧化酶(POX)对氮沉降量增加的响应，旨在探讨长期氮沉降增加对兴安落叶松人工林土壤酶系统的影响方式及其机制。

1 实验地区与研究方法

1.1 实验样地点自然概况

样地位于东北林业大学帽儿山林场老山生态定位站(45°20′N，127°34′E)。该地处长白山系张广才岭西北部小岭余脉，代表着东北东部山区天然次生林的典型生态系统类型，广泛分布着天然次生林和红松人工林及兴安落叶松人工林。该区域有明显的四季交替，年平均气温2.8℃，年相对湿度70%，年降水量723.8 mm，降雨主要集中在7～8月，年蒸发量1 093.9 mm，年平均日照数总时数2 471.3 h，早霜一般在8月末出现，晚霜截止到5月末，无霜期120～140 d。

1.2 实验样地设置和处理

2010年4月在兴安落叶松人工林内设立6个10 m×20 m的标准样地，样方之间留有15 m左右的缓冲带以防止相互干扰。试验分为2个处理组，对照处理(CK：0 kg·N·hm-2·a-1)和无机氮处理(IN：10 kg·N·hm-2·a-1)，每个处理组含3个重复，同一处理由随机选择的3个样方组成。从2010～2017年，每年5～10月，每月底喷洒硝酸铵(NH4NO3)溶液，每个样方每次将定量的NH4NO3溶解在50 L自来水中，采用背式喷雾器均匀喷洒在无机氮处理样方内，对照样方喷施等量的自来水。

1.3 样品采集与处理

2017年10月14日，在每个样地内随机选取五个地点，每个地点收集土壤酶活性较高的表层土(0～10 cm)[12]，不包括表层凋落物，混匀过2 mm孔径筛网，装入自封袋内立即带回实验室。在实验室内，每个土样分别取100 g，放入65℃烘箱内，烘干至恒重，测定其含水率。将剩余的各袋土样每袋均分成两份，一份放于室内自然风干，用于测定土壤元素；另一份放置于-20℃恒温冰箱内，用于测定土壤酶活性。

1.4 酶的测定方法

本研究中所涉及的土壤酶包括土壤中与碳(BG和CBH)、氮(LAP)和磷(AP)元素有关的酶类，和促进腐殖质形成的最重要的两类酶(POX和PER)[13]。BG的主要功能是将纤维二糖和低聚糖水解为葡萄糖[14]，分解纤维素、甲壳素和碳水化合物等[15]。CBH水解纤维素分子非还原端的二聚体，将其水解为单糖[16]。LAP水解多肽链N段的疏水氨基酸，以及其他种类的氨基肽酶[17]。AP的作用是水解磷酸单酯，磷酸二酯，释放磷酸盐[18]。PER和POX通过排泄或裂解进入环境，参与丹宁和木质素降解、腐殖化、碳矿化和溶解有机碳输出等关键生态系统功能[19]。以上6种酶的测定方法和底物见表1，所得结果统一单位为nmol·h-1·g·SOM-1，即每小时每克鲜土分解相应底物产生特定产物的物质的量。

表1 土壤酶名称、缩写、国际分类号(EC)、活性测定方法及其底物

土壤有机碳采用重铬酸钾外加热法测定，全氮采用半微量凯氏定氮法测定，全磷采用钼锑抗比色法测定。

1.5 数据处理与分析

数据处理与分析采用Microsoft Excel2007和SPSS20.0完成。

2 结果与分析

2.1 长期添加氮各土壤酶活性变化

经过8年连续添加无机氮，兴安落叶松人工林土壤中BG和AP活性分别上升5.56%和8.66%，且差异显著(P<0.05)。PER活性上升0.61%，但差异不显著。而CBH、POX和LAP活性分别下降10.71%、3.85%和12.30%，均差异显著(P<0.05)。土壤中有机碳上升0.8%，全氮上升12.66%，全磷下降2.38%。土壤的pH值下降，含水率下降(表2)。

图1 长期添加无机氮后不同种类酶活性变化 BG.β-1,4-糖苷酶；CBH.纤维素二糖水解酶；LAP.亮氨酸氨基肽酶；AP.酸性磷酸酶；POX.多酚氧化酶；PER.过氧化物酶Fig.1 Changes of enzyme activities in different kinds of enzymes after adding inorganic nitrogen for a long-term BG.β-1,4-glucosidase；CBH.Cellobiohydrolase；LAP.Leucine aminopeptidase；AP.Acid phosphatase；POX.Phenol oxidases；PER.Peroxidase

2.2 长期添加氮各土壤酶之间相关性变化

相关性分析表明，长期添加无机氮后，LAP与BG相关性增强，相关系数上升至0.999。AP与POX相关性增强，相关系数上升至0.821,；AP与PER相关性也有增强，相关系数上升至-0.966。POX与PER由正相关变为了负相关。这些具有代表性的相关系数的变化，说明参与土壤物质循环的水解酶和参与腐殖质形成的氧化酶之间的相关性在氮沉降的影响下发生了变化(表3～4)。

表2 样地0～10 cm土壤基本理化性质

表3 未施氮样地土壤各酶相关性

注：*代表P<0.05水平显著；**代表P<0.01水平显著 下同。

Note：*represent significance atP<0.05 level；**represent significance atP<0.01 level The same as below.

表4 施氮样地土壤各酶相关性(n=6)

3 讨论

3.1 添加无机氮对有机碳循环相关土壤酶(BG、CBH)活性的影响

由于大量的氮化合物进入大气，过量的氮输入造成了森林衰退和土壤酸化等现象，可能对土壤酶的活性产生了影响[9～11]。本研究基于我国东北地区的研究结果发现，长期添加无机氮的兴安落叶松人工林样地土壤BG活性增强，有机碳含量上升，LAP与BG相关性增强。这可能是由于长期添加无机氮后，氮元素利用性增强，导致与碳循环的相关的BG活性增强，微生物对有效碳源即容易被分解利用的有机碳需求相应增加。且与深层土壤相比，表层土壤受凋落物分解的影响明显，野外采样时发现根系分布较多，这些因素都有利于表层土壤中微生物的活动[20]，加之其具有良好的理化性质，所以氮沉降量增加使BG活性增强，促进了土壤中的碳循环，土壤中有机碳含量上升也证明了这一点。国内外对不同类型生态系统的研究也得到类似的结论[21～22]。另一个与碳循环相关的CBH活性降低可能是因为CBH本身活性不高，加之降水量较低，所以导致CBH活性不升反降。Robert对糖槭——红橡木和黑橡木——白橡木混合林地的研究中，也发现CBH活性与降水量呈显著的正相关关系[9]，本试验样地降水量(723.8 mm)明显低于Robert研究样地降水量(838 mm)。

3.2 添加无机氮对氮循环相关土壤酶(LAP)活性的影响

研究结果显示LAP活性下降。一方面，这可能是因为长期添加无机氮导致微生物对于氮元素的需求达到饱和，不再需要LAP水解产生更多的氮元素，外源施加的氮元素已经满足正常的氮循环需要，甚至已经“供大于需”；另一方面，LAP活性与土壤pH值呈正相关[15]，长期添加无机氮导致土壤pH值下降，而土壤酸化也导致LAP活性下降。LAP活性下降说明长期添加无机氮后，土壤中微生物对于氮的需求量越来越少，继续添加无机氮并没有促进微生物对含氮化合物的分解，所以参与水解多肽链N段的疏水氨基酸的LAP活性下降。

3.3 添加无机氮对磷循环相关土壤酶(AP)活性的影响

研究结果显示土壤AP活性增强。这可能是因为在对氮元素的需求量达到饱和的情况下，对磷元素的需求相应的增加，所以参与水解磷酸单酯，磷酸二酯，释放磷酸盐的AP活性增强；而土壤pH值的下降也会促进AP活性增强。这与国际上诸多研究结果相似[9,15,18]。而AP与PER和POX之间的相关性增强证明在腐殖质形成的过程中对磷元素利用性增强。

3.4 添加无机氮对腐殖质形成相关土壤酶(PER、POX)活性的影响

研究结果显示外源无机氮添加后，POX活性下降，PER活性增强，POX与PER间由正相关变为负相关。这可能是因为土壤氮含量升高，不需要水解产生新的氮元素，其他元素依旧需要，但总体呈现出凋落物分解受到抑制，在土壤中积累的现象，抑制土壤有机质分解增加土壤有机碳贮存量，这与土壤中碳和磷元素的变化相呼应。POX的活性是分解速率变化最好的预测因子，POX活性增强，周转率随之上升，反之下降[23]。本研究中可以看出，长期添加无机氮，抑制了凋落物的分解，周转率下降。黄玉梓[24]和Pregitzer等[25]也得到了相似的研究结果。

4 结论

研究发现，氮沉降影响土壤酶活性、凋落物分解及土壤有机质形成。氮沉降导致土壤酶活性变化各异，与碳和磷元素循环相关的酶活性增强，与氮元素循环相关的酶活性降低，说明氮沉降促进了土壤中碳和磷元素循环。POX活性降低，PER活性增强，则表明土壤中凋落物持续积累，周转率下降。本文研究了长期氮沉降对东北地区兴安落叶松人工林土壤酶活性的影响，今后还需进一步研究氮沉降对其他植被类型土壤酶活性的影响，以便对比氮沉降对不同植被类型带来的影响存在的差异，寻找变化规律。