冰冻切片技术在铁皮石斛显微结构上的应用

蒋素华 梁 芳 张 燕 周一冉 郭梦园 袁秀云 崔 波*

(1.郑州师范学院生物工程研究所，郑州 450044； 2.郑州大学生命科学学院，郑州 450002)

铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)属兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)，为多年生附生草本植物，有着药用价值和悠久的使用历史[1～2]。我国石斛属植物共有74种[3]，而铁皮石斛药效最佳，但现存与铁皮石斛近似的其他石斛物种就超过了20余种[4～5]。目前，铁皮石斛植株及其根、茎、叶的提取物已被广泛应用于中药、化妆品等领域，并有着深远的应用前景。

铁皮石斛具有典型的单子叶植物根的结构，仅在细胞大小、层次及排列上有所变化[6]；铁皮石斛的根无主根和侧根之分，没有根毛，根部有菌根真菌共生，与一般的营养根没有根本差异，根由根被、外皮层、中皮层、内皮层、韧皮部、木质部、维管束和髓组成[7]。关于铁皮石斛对根部切片的研究颇多，而其茎有着重要的药用价值，所以对茎部的研究仍需推进，茎主要由表皮、薄壁细胞和维管束组成，表皮细胞呈扁平状，薄壁组织细胞大小区别显著，相间排列，维管束为圆形或椭圆形，散布在基本组织中。铁皮石斛叶片的形态特征及其结构可以很好的反映它的生长特性，以及对温度、光照、氧气等周围环境的表达和适应性[8]。总的来说，对铁皮石斛根、茎、叶显微结构的研究意义重大。因此，该实验采用改进的蔗糖保护—液氮速冻冰冻切片法观察铁皮石斛根、茎、叶的显微结构。与传统的石蜡切片相比，冰冻切片具有用时短、简便、易操作等优点，并且有利于展开一些关于细胞学领域的研究[9]。此技术解决了利用普通的石蜡切片观察植物样品时需要进行浸透、失水、包埋等操作繁琐、切片用时长的问题。冰冻切片技术已广泛应用于动物和人体的研究中[10]，但由于植物细胞组织的特殊性，如何在植物的研究中进行应用和推广变得非常重要。目前，冰冻切片法仅应用于对少数植物器官和组织切片的研究探索[11]。此外，冷冻后的植物材料因为有大量水分的存在，会比动物材料的硬度大，进而难以获得较完整的切片，以及难以保持其组织结构的完整性。一般来说，植物的茎部和叶片含水量都较大，而根部含水量相对较少[12]。所以，在以往的很多实验中，都很难看到完整的茎部和叶片的显微结构。冰冻切片的研究进展由于还存在许多未知，所以也成为大家密切关注的研究动向。本研究利用光镜和改进的蔗糖保护—液氮速冻冰冻切片法，观察铁皮石斛根、茎、叶的显微结构。此方法在直接包埋法冰冻切片的基础上，加入蔗糖保护液，抽真空，使材料失水，放入液氮中速冻1～2 min，然后才进行包埋切片，减缓了植物材料在低温环境的冷冻过程中可能出现的细胞破损、冰晶损伤。此研究将有助于兰科植物相关基因的亚细胞定位工作的开展，在兰科植物显微结构、原位杂交和组织化学研究中将具有广阔的应用前景。

2 材料与方法

2.1 材料

分别取新鲜铁皮石斛幼苗期的根、茎、叶作为实验材料。试验仪器包括LEICA CM1950冰冻切片机、显微镜DM2500(LEZCA)。试验试剂为液氮、蔗糖、磷酸缓冲液、OCT包埋剂。

2.2 冰冻切片方法的优选

2.2.1 不同蔗糖保护液对冰冻切片效果比较

将切取的根分别浸泡在含有4%、8%、16%蔗糖溶液中1 h，分别用对应相同蔗糖质量分数的磷酸缓冲液进行浸洗4～5次，每次2 min，然后抽真空，直到根沉到管底，之后便直接放到液氮中冷冻30 s，用OCT包埋剂在载物台上直接包埋，-20℃环境下冷凝10 min，切片厚度为厚度为15 μm，放进样品头中开始切片，分别用干净的载玻片展片，观察、比较切片效果，茎和叶处理同上。

2.2.2 不同冷凝温度对冰冻切片效果比较

将根、茎和叶分别于-15℃、-20℃、-25℃环境下冷凝10 min，切片厚度为厚度为15 μm，分别用干净的载玻片展片，观察、比较切片效果。

2.2.3 不同切片厚度对冰冻切片的效果比较

根、茎和叶在-20℃环境下冷凝10 min，切片厚度分别保持在10、15、20 μm，用干净的载玻片展片，观察，比较切片效果。

2.2.4 切片评价

切片制作过程中，分别从舒卷度、薄厚度、完整度以及显微观察效果四个方面来评价切片的效果，选出最佳切片进行染色(表1)。

2.3 冰冻切片与观察

将根浸泡在4%蔗糖的溶液中，在-25℃环境下冷凝10 min，切片厚度20 μm；将茎固定在16%蔗糖的溶液中，在-20℃环境下冷凝10 min，切片厚度15 μm；切取的叶片先固定在16%蔗糖的溶液中，在-20℃环境下冷凝10 min，切片厚度10 μm，分别用干净的载玻片展片，染色、观察切片效果。

表1 铁皮石斛冰冻切片感官评价标准

Table 1 Sensory evaluation criteria for cryo-sectioning ofD.officinale

项目ProjectⅠ级ⅠclassⅡ级Ⅱ classⅢ级Ⅲ classⅣ级Ⅳ class伸卷度Stretch roll degree+++---厚薄度Thickness+++---完整度Integrity+++---显微效果Effect of microstructure+++---

注：“+”表示切片较舒展、厚度较薄、完整度好以及显微视觉效果清晰；“-”表示切片卷曲、厚度很厚、完整度差、显微视觉效果不清晰且严重重叠或切片不完整。符号越多，相应的效果越明显。

Note:“+” means that slices were more stretched,thinner,more complete and had a clear microscopic visual effect. The more “+”,the better the result. “-” means that slices were curl,thickness,poor integrity,unclear microscopic visual effect and serious overlap or incomplete. The more “-”,the worse the result.

3 实验结果

3.1 不同蔗糖保护液液对冰冻切片的效果比较

分别比较了蔗糖保护液液质量体积分数为4%、8%、16%的切片效果(图1)，根在蔗糖固定液浓度为8%时效果较好(图1A)，细胞正常，无收缩，切片比较完整，能清晰地看到表皮、皮层、维管柱。茎在蔗糖固定液浓度为16%时效果较好(图1B)，细胞有轻度收缩，切片薄且完整，能清晰地看到表皮、维管束以及薄壁细胞。叶在蔗糖固定液浓度为4%时效果较好(图1C)，组织结构清晰完整，轻度收缩，能观察到上下表皮，叶肉细胞和维管束。植物细胞根、茎、叶含水量不同，根的含水量较茎和叶少，茎的含水量和叶片的含水量都很高，而蔗糖可以使其失水，所以根、茎、叶的最适蔗糖固定液浓度分别为8%、16%、4%(表2)。

图1 不同蔗糖保护液对根、茎、叶冰冻切片的效果比较 A.根；B.茎；C.叶Fig.1 Comparison of effects of different sucrose preservatives on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

表2 不同浓度蔗糖保护液的比对

Table 2 Comparison and analysis of sucrose protective solutions with different concentrations

蔗糖保护液Sucrose protectiveliquid(%)完整度Integrity显微效果Effect of microstructure根Root茎Stem叶Leaf根Root茎Stem叶Leaf4+------+8---+--16--++-+-

注：“++”表示Ⅰ 级；“+”表示Ⅱ级；“-”表示Ⅲ级；“--”表示Ⅳ级 下同。

Note:“++” express Ⅰclass; “+” express Ⅱ class; “-” express Ⅲ class; “--” express Ⅳ class The same as below.

3.2 不同冷凝温度的冰冻切片效果比较

不同的冷凝温度对植物组织的包埋稳定度影响较大，根在-25℃时包埋稳定度最高，切片时不粘连， 不粉碎， 不易卷缩； 茎和叶在-20℃时包埋

表3 不同冷凝温度对冰冻切片效果比较

Table 3 Comparison of the effect of different condensing temperatures on cryo-sectioning

冷凝温度Condensing temperature(℃)伸卷度Stretch roll degree根Root茎Stem叶Leaf-15----20++++-25+++-

稳定度较高，切片时易伸展，不卷缩。分别比较了不同冷凝温度下的切片效果(图2)，根在冷凝温度为-25℃时效果较好(图2A)，能清晰地看到显微结构，如表皮、皮层及维管柱。茎在冷凝温度为-20℃时效果较好(图2B)，此时能清晰地看到茎的表皮、薄壁细胞和维管束。叶在冷凝温度为-20℃时效果较好(图2C)，图片较完整，结构较清晰(表3)。

图2 不同冷凝温度对根、茎、叶冰冻切片的效果比较 A.根；B.茎；C.叶Fig.2 Effects of different condensing temperatures on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

图3 不同切片厚度对根、茎、叶冰冻切片的效果比较 A.根；B.茎；C.叶Fig.3 Effects of different section thicknesses on cryo-sectioning of roots,stems and leaves A.Root; B.Stem; C.Leaf

3.3 不同切片厚度的冰冻切片的效果比较

切片厚度直接影响组织的清晰度与完整度(表3)，经过比较分析，根的切片厚度保持在20 μm时效果较好(图3A)，此厚度下的根切片比较完整，结构也清晰。茎在切片厚度保持在15 μm时效果较好(图3B)，此厚度下的茎可以看到清晰地表皮、维管束、薄壁细胞。叶在切片厚度保持在15 μm时效果较好(图3C)，此厚度下叶的显微结构效果较好，清晰且完整(表4)。

表4 不同切片厚度对冰冻切片效果比较

Table 4 Comparison of the effect of different slice thickness on cryo-sectioning

切片厚度Slice thickness(μm)厚薄度Thickness根Root茎Stem叶Leaf10---15++++20---

图4 铁皮石斛根的切片效果Fig.4 Effect of root section on D.officinale

3.4 冰冻切片与观察

铁皮石斛无主根和侧根之分，根的横切面从外到内依次为根被、皮层和中柱。表皮细胞有3～5层细胞，其细胞多呈长筒形，呈45°辐射状排列。根被主要起吸水、保护、透气、减少内部组织细胞水分流失的作用[13～15]。根被向内是皮层组织，由15～16层细胞组成占整个根组织的绝大部分，皮层组织又分为三个皮层：外皮层，内皮层、中皮层，根的中心部分称为中柱，由韧皮部、维管束、木质部和髓组成(图4)。

铁皮石斛茎直立多节、丛生、不分枝、呈圆柱形，通常长9～35 cm，粗3～5 mm，表皮细胞呈扁平状，皮下层有1列长多角形的细胞，壁较厚。薄壁组织细胞大小区别显著，相间排列，维管束为圆形或椭圆形，散布在基本组织中，木质部和韧皮部构成一束束的维管束，分散在薄壁细胞之间(图5)。

铁皮石斛叶的表皮细胞呈不规则多边形，上表皮细胞较下表皮细胞大，叶肉组织分布均一，叶肉细胞含大量叶绿体，叶片为平行叶脉，叶脉为大维管束，维管束外均分布有一层小型薄壁细胞(图6)。

图5 铁皮石斛茎的切片效果Fig.5 Effect of stem section on D.officinale

图6 铁皮石斛叶的切片效果Fig.6 Effect of leaf section on D.officinale

4 讨论

冰冻切片可以缩短常规石蜡切片缓慢而复杂的处理过程，减少对样品组织活性物质的损伤，更好地保存生物分子活性，且具有快速、简便、易操作等特点[16]。在实验中，采用改进的蔗糖保护—液氮速冻冰冻切片法观察铁皮石斛根、茎、叶的显微结构，从而确定出铁皮石斛根、茎、叶冰冻切片的最适条件：根在蔗糖固定液浓度为4%，冷凝温度为-25℃，切片厚度保持在20 μm时效果较好；茎在蔗糖固定液浓度为16%，冷凝温度为-20℃，切片厚度保持在15 μm时效果较好；叶在蔗糖固定液浓度为16%，冷凝温度为-20℃，切片厚度保持在10 μm时效果较好。

植物细胞具有大液泡，植物细胞中大量的水分使植物样品更容易在低温冷冻过程中形成冰晶，损伤植物细胞的细微结构，即“冰晶损伤”[17]，对于植物组织来说，蔗糖是一种很好的固定液，蔗糖可以使植物细胞失水，液氮可以及时速冻，在细胞失水之后尽量减轻因冷冻造成的冰晶损伤；快速冷冻是解决这一问题的主要措施之一，而使用冷冻保护剂可以降低细胞内溶液的冰点，减小形成冰晶的机会[18]。陈丹等[19]对烟草顶芽冰冻切片的研究表明，蔗糖浓度为40%时，虽然芽整体结构保持较完整且分生组织不受影响，但分生组织周围的薄壁细胞却有不同程度收缩，本研究采用4%～16%的蔗糖浓度，得到了良好的效果。实验采用改进的蔗糖保护—液氮速冻冰冻切片法，对铁皮石斛的根、茎、叶的显微结构进行观察、分析、总结，可进一步为铁皮石斛的结构和植物学鉴定提供参考，同时也为兰科基因组织差异表达和定位，以及原位杂交与组织化学染色提供冰冻切片的关键技术。