糖通饮对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用*

高楠楠， 侯胜开， 屈璐， 潘艳伶,2**

(1.贵州医科大学 临床医学院 中医学教研室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 贵州省常见慢性疾病发病机制及药物研究重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

中国人群中糖尿病(dabetes mellitus,DM)的总患病率为11.6%，约1/3会发展为糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)，这是DM最严重的并发症之一，存在发生进展性肾病的高风险[1]。DN患者早期表现为不同程度的蛋白尿和肾小球高滤过，进而出现肾小球萎缩、肾小管细胞外基质堆积和基底膜增厚等情况，最终可发展为慢性肾功能不全[2]。一旦发展至终末期肾脏病，病情将不可逆转，最终危及患者生命安全[3]。因此早期诊断和治疗DN是预防肾脏损害、延缓病情的关键所在。本实验通过观察早期DN大鼠的空腹血糖(FBG)、血清肌酐(SCr)、24 h尿蛋白定量及肾脏组织的病理形态学的改变，探讨糖通饮对早期DN大鼠肾脏的保护作用，为临床用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要仪器及试剂

1.1.1实验动物 健康SPF级雄性SD大鼠55只，体质量(180±20)g，由贵州医科大学实验动物中心提供[许可证号为SCXK(黔)2002-0001]。

1.1.2主要药品、试剂及仪器 糖通饮(由生地黄、山药、山萸肉、茯苓、泽泻等10味中药组成)由贵州医科大学附院提供,链脲佐菌素(STZ)由美国Sigma公司生产,厄贝沙坦片(科苏)由扬子江药业集团北京海燕药业有限公司生产,BCA蛋白浓度测定试剂盒由北京索莱宝公司提供,血清(SCr)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。主要仪器:强生稳豪型血糖测试仪[强生(中国)有限公司]、ACS-LEAS电子计重秤、BIO96孔酶标板、 TDL-5-A型台式大容量离心机、Leica TP1020半自动脱水机、Leica EG1150H包埋机、Leica CM2245轮转式石蜡切片机、BioTek-SYNERGYH4酶标仪等。

1.1.3样品前处理 糖通饮加适量双蒸水，用专用的器皿进行熬制，熬制90 min，生药含量浓缩至1 000 g/L，药物冷却后置于4 ℃冷藏保存。

1.2 方法

1.2.1动物模型复制方法 SPF级雄性SD大鼠55只，普通饲料适应性喂养1周后随机分为正常组(A组)10只、造模组45只。造模组给予高脂高糖饲料(普通饲料+50%猪油+1%胆固醇+0.2%胆盐+20%糖)喂养6周，造模前禁食(不禁水)12 h，SD大鼠称重后，给予1% STZ的柠檬酸缓冲液(pH 4.5)按20 mg/kg首次剂量腹腔注射，此后每隔72 h注射1次STZ(共需注射2次或3次)，且在首次剂量的基础上增加5 mg/kg剂量；正常组给予同等剂量的柠檬酸钠缓冲液，大鼠于每次注射72 h后尾静脉取血测FBG，当血糖值≥16.7 mmol/L,且饮水量和尿量明显增多，则判定为DM模型选模成功。模型建立后，继续予高脂高糖饲料喂养，3周后代谢笼收集24 h尿液，24 h尿蛋白≥30 mg[4]，即判定为DN模型造模成功。

1.2.2分组及给药 将造模成功的40只DN大鼠随机分为模型组(B组)10只，糖通饮组(C组)10只，厄贝沙坦组(D组)10只及糖通饮+厄贝沙坦组(E组)10只。C组糖通饮煎剂[按12 g/(kg·d)]给予灌胃治疗(大鼠用量按人与动物体表面积的等效比值表折算)，间隔6 h再次给予等量生理盐水灌胃1次，连续给药8周；D组厄贝沙坦片[按照13 mg/(kg·d)]稀释于7.5 mL生理盐水中给予灌胃治疗(大鼠用量按人与动物体表面积的等效比值表折算)，间隔6 h再次给予等量生理盐水灌胃1次，连续给药8周；E组给予糖通饮煎剂[按12 g/(kg·d)]灌胃治疗，间隔6 h再次给予厄贝沙坦片[按13 mg/(kg·d)]悬浊液灌胃1次，连续给药8周；A、B组均给予等量的生理盐水灌胃，每日2次，连续灌胃8周。

1.2.3标本收集 各组大鼠灌胃8周后，禁食(不禁水)12 h，置于代谢笼中收集24 h尿液，尾静脉取血测FBG；电子天平称量体质量，按0.3 mL/100 g体质量给予10%水合氯醛腹腔注射麻醉动物，腹主动脉取血，摘除大鼠右侧肾脏，生理盐水冲洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 指标测定

1.3.1FBG、SCr、24 h尿蛋白检测 尾静脉收集的血液标本检测FBG。鼠笼收集的24 h尿液过滤沉渣、量体积后置离心机上3 000 r/min，4 ℃离心10 min，取上清液，双辛丁酸法(BCA)检测24 h尿蛋白。腹主动脉取血，冰上静置30～60 min，3 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液，肌氨酸氧化酶法检测SCr。

1.3.2苏木素-伊红(HE)染色 将4%多聚甲醛溶液固定的大鼠肾脏常规脱水、石蜡包埋、切片；将切好的片子置于65 ℃烘箱进行烤片45 min,二甲苯脱蜡后下行脱水，洗涤5 min，苏木素染液染色8 min,冲洗至水清,1%HCl酒精快速分化3 s，伊红染色3 min，冲洗至水清、脱水、透明、封片，光镜下观察并拍照。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料

45只SD大鼠造模，死亡5只；由于实验周期较长，在此期间B组出现严重并发症死亡3只，灌胃治疗时E组由于药物不耐受死亡4只，D组死亡3只，C组死亡2只，最终纳入结果分析的总共38只SD大鼠。

2.2 FBG、SCr及24 h尿蛋白水平

与A组比较，B组的FBG、SCr及24 h尿蛋白明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与B组比较，C、E组的FBG、SCr及24 h尿蛋白明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；D组的SCr和24 h尿蛋白较B组明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，FBG差异无统计学意义(P>0.05)。 见表1。

组别nFBG(mmol/L)SCr(μmol/L)尿蛋白(mg/24 h)A组105.24±0.33 41.28±5.29 26.90±8.22 B组727.10±1.29(1)113.78±25.42(1)132.87±39.69(1)C组822.82±3.02(2)72.49±22.01(2)98.60±13.95(2)D组725.05±2.3666.33±19.93(2)99.53±33.83(2)E组620.93±4.28(2)65.39±22.10(2)83.17±30.05(2)

(1)与A组比较，P<0.01；(2)与B组比较，P<0.05

2.3 肾脏组织形态学

A组大鼠肾脏组织结构排列整齐，肾小球、肾小管未见明显异常；B组大鼠肾脏组织的病理形态结构，表现出明显的肾小球基底膜增厚、细胞外基质积聚、肾间质纤维化；与B组比较，C、D、E组治疗后上述病理改变均明显减轻。见图1。

3 讨论

DN是糖尿病最常见的慢性并发症之一，也是全球终末期肾功能衰竭的主要原因[5-6]。DN最常见的临床表现是蛋白尿，病理特征是肾小球纤维化，基底膜增厚，细胞外基质积聚等。正常的肾脏具有屏蔽蛋白质的作用，当肾脏出现异常，肾小球受损，蛋白质通过率增加，尿液中蛋白含量亦随之增加，从而出现大量蛋白尿[7]。蛋白尿的形成与肾脏血流动力学改变引起的系膜基质扩展和基底膜增厚等肾间质纤维化病理改变密切相关[8]。现代临床医学研究中对其发病机制尚未明确。但有研究指出，DN发病机制包括遗传因素，氧化应激，血液动力学因子等[9]。目前，现代医学主要采用血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体阻断剂(ARBs)两类药物对肾素-血管紧张素系统(RAS)进行阻断[10]。虽然DN病情得到一定程度的延缓或控制，但因其单用时存在较多不良反应，影响DN的治疗效果[11]。近年来中医药凭借副作用少、毒性低等优势在预防DN等方面受到广泛关注[12-13]。有研究发现糖肾I号、自拟益气活血方、三七皂苷等均能显著降低DN大鼠的血糖值，减少蛋白尿的排出[14]。亦有学者发现清热益气通络方能够降低DN大鼠的24 h尿蛋白，且效果优于厄贝沙坦[15]。

图1 各组大鼠肾脏组织染色结果(HE，×400)Fig.1 Histological changes of kidneys in each group

古代医书中并无“糖尿病肾病”此称，后世医家将其归属于“消渴”、“尿浊”等范畴。本实验选方糖通饮，是由全国名老中医凌湘力教授根据多年治疗糖尿病的临床经验所拟的经验方，凌教授认为DN属于消渴变证，是以气阴两虚为本、瘀血阻络为标[16]。气虚导致血运无力，阴亏导致血行不畅，久病成瘀，瘀血阻络，损伤肾络；同时凌教授认为瘀血是DN发生发展最主要的病理产物[17]。本药方在六味地黄丸的基础上配伍黄芪、丹参、地骨皮、草决明而成，具有益气养阴保肾、活血化瘀通络之功[18]。现代药理学研究证明，六味地黄丸能够抑制氧化应激反应，上调细胞红蛋白的表达，从而预防肾纤维化和保护肾小球系膜细胞[19]。黄芪及其提取物能有效减少空腹血糖和蛋白尿水平，降低纤维化，从而保护肾脏，改善全身状态[20]。丹参能够抗氧化、降血糖、改善肾组织纤维化程度，保护肾脏，延缓慢性肾脏疾病的进展[21]。有文献指出地骨皮不仅能够降血糖, 还可用于降血压、降血脂[22]。草决明亦在降血压、抗氧化、降血脂等多方面疗效显著[23]。

本实验结果显示，糖通饮与能够有效地减少早期DN大鼠的24 h尿蛋白，降低FBG和SCr水平；厄贝沙坦片虽具有降低SCr和24 h尿蛋白的作用，但其降糖效果不明显，而两者联合应用时，降糖效果优于厄贝沙坦单独应用；肾脏组织形态学方面，糖通饮可以减轻早期DN大鼠肾小球细胞外基质积聚、肾小球基底膜增厚情况，改善肾脏纤维化状态，从一定程度上延缓早期DN发展至终末期肾病的进展，为名老中医经验方糖通饮的临床推广及应用提供科学的理论依据。